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1、细胞培养基础知识 已有 288 次阅读 2011-5-24 22:41|系统分类:科研笔记|关键词:细胞 培养液 微生物细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供 细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的 生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分 之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体 外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被
2、微生物或有毒物 质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细 胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的 培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基 两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供， 用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨
3、基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅 助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有 几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需 氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰 胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但 是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20冰箱中保存，在使用前加入 培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在 4冰箱中储存 2 周以上时，还应重新加 入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。 主要有葡萄
4、糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠， 钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受 260mOsm/kg 320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范 围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗 透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加 HEPES 时需按以下方 法调节钠离子浓度。 缓冲系统 大多数细胞所需 pH 在 7.2 - 7.4。但是，细胞培养最适 pH 值随培养的细胞种 类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高 pH (7.4 -
5、 7.7), 而传代转化细胞系则需 要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。 由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与 CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的 CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中 CO2 浓 度设定在 5，培养液中 NaHCO3 的加入量为 1.97g/L；如果 CO2 浓度维持在 10，培养液中 NaHCO3 的加入量为 3.95g/L。 细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。HEPES 是一种非离子缓冲液， 在 pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对 一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳
6、酸钠（0.34g/L）共用，以抵 消因额外加入 HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖 子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含 有酚红作为 pH 指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。 维生素 在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维 生素以适合更多的细胞系生长。 其它成分 在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的 DMEM 培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和 2-巯基乙醇（2- Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相 当
7、于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一 个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为 非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用 是促进分裂原的反应和 DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作 用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me 是一种小分子还原剂，极易氧化。分子量为 78.13，纯的 2-Me 是一种无色有刺 激味的液体，比重为 1.110-1.120(Do20)，常用终浓度为 510-5M。常配制成 0.1M 的储存液，用时每升培养液加 0.5ml。 液
8、体培养基保存： 液体培养基应于 4冰箱避光保存，实验前放入 37预热。未加血清液体培养 基有效期为 12 个月。液体培养基中的 L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢 慢分解。如果细胞生长不良，可以再添加适量 L-谷氨酰胺。 干粉培养基保存： 4冰箱避光保存，有效期 36 个月。 血清 细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用 的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中 分离出的血清，价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离 出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小
9、牛中取出的血清中可能含有较多的生 物活性物质，其质量明显不如前两种。 血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清 支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含 有毒性或抑制细胞生长的物质。因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持 细胞生长能力进行检测，然后再大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以 下几点： （1）需要长期保存的血清必须储存于-20 70 低温冰箱中。4冰箱中 保存时间切勿超过 1 个月。由于血清结冰时体积会增加约 10，因此，血清在 冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。 （2）一般厂商提供的血清为
10、无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则 可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。 （3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20 至 -70 低温冰箱中的血清放 入 4冰箱中溶解 1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中 需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发 生。切勿直接将血清从-20进入 37解冻，这样因温度改变太大，容易造成 蛋白质凝集而出现沉淀。 （4）热灭活是指 56, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖 晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必 须，一般不建议作此热处理，因为
11、热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还 会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细 胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化 和活化。 （5）切勿将血清在 37放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效 成分会破会而影响血清质量。 （6）血清中的沉淀物絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维 蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心 3000rpm, 5 分钟 去除，也可不用处理。 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些 沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一
12、般情况下，此 小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另 一批号的血清。 细胞培养环境 1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和 不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因 素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原 则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室， 而洗刷消毒在另一室。 2、常用设施及设备 （1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。 （2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净 化工作
13、台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、 冷藏器及消毒好的无菌物品等。（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处 理物 （4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 （5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。 3、培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。 器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙 烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。 （1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有 500ml、250ml、100ml 等几种。 （2）培
14、养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培 养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口 径一般不小于 1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有 200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。 （3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径 30mm、60mm、120mm 等几 种。 （4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管 上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用 1ml 和 10ml 两种。 短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。 （5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同
15、形态各样， 常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分 别为 50ml、30ml、15ml；后者则多为 10ml 和 5ml。 （6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。 4、细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温 度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为 36.50.5，偏离这一温度范 围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高 温强，温度上升不超过 39时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在 39-401 小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在 40-411 小时，细胞会普遍 受到损伤
16、，仅小半数有可能恢复；41-421 小时，细胞受到严重损伤，大部分 细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在 43以上 1 小时，细胞全部死亡。 相反，温度不低于 0时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放 入 2535时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在 4数小时后，再回 到 37培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰 点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量 的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如80或196（液氮） 长期保存。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的 各种成分。 开放培养时一般把细胞置于 95%空气加 5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳 既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用 在于维持培养基的 pH 值。大多数细胞的适宜 pH 为 7.2-7.4，偏离这一范围
