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1、第五章 基因的体外重组和转化第一节 DNA片段的体外连接 第二节 重组体导入细菌细胞磷酸二酯键的形成磷酸二酯键的形成DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶第一节、第一节、DNADNA片段的体外连接片段的体外连接连接方式：连接方式：黏性末端的连接黏性末端的连接平头末端的连接平头末端的连接修饰黏性末端的连接修饰黏性末端的连接PCRPCR产物的连接产物的连接GatewayGateway载体构建体系载体构建体系一、黏性末端的连接黏性末端连接(Cohesive end ligation)：具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DN
2、A。 1.同种酶产生的黏末端的连接优 点经济省时，操作方便；外源片段容易回收；问 题n载体自身环化 n插入片段可双向插入 2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点无相同的限制酶识别位点，有同尾酶Sal片段（CAGCTG） Xho 片段(GAGCTC) G3 G3 CAGCT5CAGCT5C3 C3 GAGCT5GAGCT5DNA连接酶讨论：连接后的重组分子还能被这两种限制酶切割 么？n若均不是以上情况呢？二、平末端的连接平末端连接(blunt end ligation)：在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双
3、链DNA分子连接成杂种DNA分子。平端连接平端连接AGCTAGCTTCGATCGAAluAluT4T4DNADNA连接酶连接酶AGCT AGCTAGCT AGCT TCGA TCGATCGA TCGA优 点可以用T4连接酶连接任何DNA平 端 l5-突出粘性末端的补齐可用Klenow聚合酶补齐l3-突出粘性末端的削平可用T4 DNA聚合酶削平 主 要 问 题连接效率低高浓度的底物和T4 DNA连接酶添加凝聚剂：如聚乙二醇不易回收外源DNA片断双向插入三、修饰黏末端连接n同聚物加尾法：同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA的
4、3端各加上一段寡聚核苷酸, 制成 人工粘性末端, 然后在DNA连接酶的作用 下, 连接成为重组的DNA。 优 点不会发生自身环化作用；连接效率较高；存在问题n操作繁琐n外源片段难回收n可能会影响基因表达n衔接物连接法衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由812个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。nDNA接头法：DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。人工接头连接人工接头连接BamHIBamHIBamHBamHIBamHIn讨论如何将一平末端的DNA片段与BamH形成的粘性末端连接
5、？（P156.4）四、PCR产物的连接1.限制性内切酶酶切位点引入法在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。（1）在引物上添加酶切位点！注意 添加保护序列nPrimer1:5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAnPrimer2:5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 引入的酶切位点是单一的（2）利用突变在引物5端引入酶切位点通过在PCR引物序列的5端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。2.T-A克隆利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在707
6、5活性高)，使PCR产物的3末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中.35T载体35 载体T3535AAPCR产物Taq 酶PCR扩增+ 335 PCR产物AA5T载体TT5 533连接转化蓝白筛选目的片段T载体的构建： n用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与MobII 酶切产生3末端未配对的T； n应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3末端。 n应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。 五、Gateway载体构建系统Gateway技术：一种克隆操作平台：把目的基因
7、克隆到入 门载体（Entry Vector）后，就不用依赖 限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重 组位点和重组酶，高效、快速地将目的基 因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。Gateway技术的灵活性：n整合后的附着位点为attL（BOP）attR（POB）n整合位点-attB attP切除位点-attL attRn整合过程需要介导蛋 白和重组位点。第二节、重组体导入细菌细胞n转化(transformation):受体细胞捕获并表 达质粒DNA的生命过程；n转染(transfection):受体细胞捕获并表达 噬菌体DNA的生命过程；n转导(transdu
8、ction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。 重组体的转化重组体的转化受体细胞受体细胞重组体的转化重组体的转化受体细胞的选择受体细胞的选择（1 1）具有接受外源）具有接受外源DNADNA的能力；的能力；（2 2）限制酶缺陷型；）限制酶缺陷型；（3 3）DNADNA重组缺陷型；重组缺陷型；（4 4）不适于在人体内或非培养条件下生存；）不适于在人体内或非培养条件下生存；（5 5）它的）它的DNADNA不易转移。不易转移。一、大肠杆菌感受态的制备 感受态：细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态就称为感受态。1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA。此后
9、不久，Cohen等人用CaCl2法实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，操作原理如下：将处于对数生长期的细菌置入0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，再加入DNA，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。CaClCaCl2 2处理处理受体细菌受体细菌CaCl2感受态感受态 细菌细菌重组体重组体转转 入细菌入细菌二、重组DNA导入大肠杆菌重组DNA转移到大肠杆菌细胞内的过程1.吸附：双链DNA分子吸附在受体菌表面2.转入：双
10、链DNA分子解链，单链DNA分子进入受体菌，另一链降解；3.自稳：外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状；4.表达：供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。JM109JM109感受态感受态含氨含氨苄平板苄平板AmAm重组重组 质粒质粒感受态感受态转化项目CaCl2受体菌DNA液体LB皿a阳性对照10ulPBR322DNA100ul 1b阴性对照10ul2ul连接液100ul 2c阴性对照10ul100ul 3d连接液转化 组60ul6ul连接液600ul 4 具体操作：冰浴30；42 2 ；冰浴2 ；加37预热LB 培养45；表中a、b、c各取100ul/皿涂布，连接 液转化组d梯度涂
11、布 I 50ul2皿；II.500ul浓缩后2 皿）37倒置培养过夜 ；检查细菌生长情况。 转化率：转化细胞转化率：转化细胞/ /细胞总数细胞总数影响因素：影响因素：细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度 试剂的质量 杂菌和杂DNA的污染 思考题：试述 DNA片段的体外连接方式 ？练习题：打算将一个cDNA克隆到一个表达载体， 以便在Ecoli中大量制备相应的蛋白质。这 个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计 划将它从BamH的位点插入载体中。实验严 格地按照克隆手册中的方法进行：载体用 BamHI切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除 去5磷酸；接着将处理过的载体同用BamH
12、I 切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后 进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的 可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后 ，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的 平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因 ，所以，转化的细菌能够存活。实验中同时设置了4个对照：n 对照1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞 涂布在培养平板上；n对照2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂 布在培养平板上；n对照3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理) 并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转 化过的细菌细胞涂布在培养乎板上；n对照4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过) 并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段
13、)的载 体转化过的细菌细胞涂布在培养子板上。在进行第一次实验时，感受态细胞不是自 己制备的，结果，在所有的平板上都长出 了多到无法计数的菌落。在第二次实验中 ，自己制备感受态细胞，但这一次，所有 的平板上都没有菌落生长。接着又进行了 第三次实验，这次得到了转化子。从实验 平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA， 并用BamHI进行切割，其中9个克隆产生大 小同载体一样的单一的一条带，另三个克 隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成 功。ncDNA 克隆的结果实验结果 制备的样品 1 2 3对照1 只有细胞 TMTC 0 0对照2 未切的载体 TMTC 0 1000对照3 省去磷酸酶处理，无cDNA TMTC 0 435对照4 无cDNA TMTC 0 25实验样品 TMTC 0 34n注：TMTC=too many to count，多到无法计数。n (1)你如何看待第一次的实验结果?对照1的 目的是什么?n (2)影响第二次实验结果的原因是什么?对 照2的作用何在?n (3)对照3和4各有什么作用?n (4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
