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1、上海市临床检验中心陈悦细菌性突发公共卫生事件 的实验室检验技术 细菌性突发公共卫生事件分类 细菌性呼吸道疾病细菌性呼吸道疾病: :群体性发热群体性发热 细菌性食源性疾病细菌性食源性疾病: :食物中毒食物中毒 细菌性生物恐怖事件细菌性生物恐怖事件: :炭疽白粉事件炭疽白粉事件细菌性呼吸道疾病 流行性脑脊髓膜炎流行性脑脊髓膜炎( (简称流脑简称流脑) ) 链球菌病链球菌病( (猩红热、人感染猪链猩红热、人感染猪链2 2病病) ) 肺鼠疫肺鼠疫 土拉热（弗朗西斯菌）土拉热（弗朗西斯菌） 肺炭疽肺炭疽 军团菌病军团菌病检验样本的选取原则检验样本的选取原则根据病情的发展,本菌可相继存在 于鼻咽腔、肺泡灌
2、洗液、血液、 淤血点及脑脊液等标本中，在实 验室检测中应取相应检材标本的检验意义标本的检验意义 脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、 肺泡灌洗液肺泡灌洗液中检出中检出病原菌病原菌可直接作为可直接作为确诊确诊 依据依据 咽拭子咽拭子一般是对一般是对健康人群或病人密切接触健康人群或病人密切接触 者者进行带菌检验时采集，进行带菌检验时采集，对病人对病人如采集此如采集此 标本，在诊断上仅有标本，在诊断上仅有参考价值参考价值CSFCSF标本的采集标本的采集 脑脊液脑脊液( (CSF)CSF)：是用于分离和鉴定病原体最好是用于分离和鉴定病原体最好 的标本的标本 取取CS
3、F2CSF23ml 3ml ，注入无菌试管内，注入无菌试管内，30003000转转/ /分分 ，离心，离心2020分钟，用无菌吸管取分钟，用无菌吸管取沉淀物沉淀物直接接种直接接种 CSFCSF沉渣沉渣还可涂片，作还可涂片，作G G染色镜检染色镜检 CSFCSF离心后的离心后的上清液上清液供做血清学检查供做血清学检查特异性抗特异性抗 原原和（或）和（或）DNADNA特异片段特异片段，以对病人进行早期，以对病人进行早期 快速诊断快速诊断 血标本的采集血标本的采集 在疾病早期，病人高热时采取静脉血在疾病早期，病人高热时采取静脉血，及时及时 分离纯培养物供鉴定分离纯培养物供鉴定 留留2 2mlml血注
4、入无菌试管内分离血清，胶乳凝血注入无菌试管内分离血清，胶乳凝 集试验检查集试验检查特异抗原特异抗原、PCRPCR测测DNADNA特异片段特异片段和和 ELISAELISA测急性期抗体测急性期抗体 在病人病后在病人病后1 12 2周采取第二次血液周采取第二次血液2 2mlml，分分 离血清检查病人恢复期抗体以作追溯性诊断离血清检查病人恢复期抗体以作追溯性诊断出血点渗出液出血点渗出液标本的采集标本的采集 选择新出现的皮疹，以选择新出现的皮疹，以75%75%酒精消毒局部皮酒精消毒局部皮 肤，用无菌针头挑破淤点或淤斑，轻轻地肤，用无菌针头挑破淤点或淤斑，轻轻地 挤出组织液挤出组织液 用无菌毛吸管吸取渗
5、出液先增菌后分离、用无菌毛吸管吸取渗出液先增菌后分离、 培养培养 将渗出液涂片，作将渗出液涂片，作G G染色镜检染色镜检咽拭子咽拭子标本的采集标本的采集 采样时，令受检者尽量张开口，用压舌板采样时，令受检者尽量张开口，用压舌板 将其舌头轻轻压下，用前端略向上弯曲将其舌头轻轻压下，用前端略向上弯曲4545 度角的无菌棉拭子探入口腔内度角的无菌棉拭子探入口腔内悬雍垂后面悬雍垂后面 的的鼻咽孔鼻咽孔部位，小心涂抹该部粘膜数次，部位，小心涂抹该部粘膜数次， 然后小心退出，注意尽量不接触口腔其余然后小心退出，注意尽量不接触口腔其余 部位部位 咽拭子直接接种到选择性平皿分离病原菌咽拭子直接接种到选择性平皿
6、分离病原菌样品的处理和运送样品的处理和运送 及时处理样品：采集样品后应尽可能地做及时处理样品：采集样品后应尽可能地做 到床边接种，若无可能则应在最短地时间到床边接种，若无可能则应在最短地时间 内送至实验室进行接种培养内送至实验室进行接种培养 早期采集样品：应尽可能采集病人用药前早期采集样品：应尽可能采集病人用药前 的早期样品，可以明显提高病原菌的检出的早期样品，可以明显提高病原菌的检出 水平水平 保温运送：保温运送：NmNm对温度较为敏感对温度较为敏感，应保持样，应保持样 品处于品处于2020 C C3636 C C之间，切不能低温运送（之间，切不能低温运送（ 检测抗体的血清标本除外）检测抗体
7、的血清标本除外） 细菌性生物恐怖事件 炭疽白粉事件：直接吸入导致肺炭疽炭疽白粉事件：直接吸入导致肺炭疽 病原体：毒力型炭疽杆菌，即含有毒素质病原体：毒力型炭疽杆菌，即含有毒素质 粒（粒（pxo1pxo1）和荚膜质粒（和荚膜质粒（pxo2pxo2）的菌株的菌株（ toxtox+cap+cap+） 并不是要从分类学的角度去决定一种细菌并不是要从分类学的角度去决定一种细菌 是不是炭疽芽孢杆菌，或蜡样芽孢杆菌的是不是炭疽芽孢杆菌，或蜡样芽孢杆菌的 炭疽亚种，而是这种细菌能不能引起炭疽炭疽亚种，而是这种细菌能不能引起炭疽 疾病。而炭疽疾病的决定因素是那两个质疾病。而炭疽疾病的决定因素是那两个质 粒上的致
8、病基因，缺一不可粒上的致病基因，缺一不可 细菌性食源性疾病 由细菌通过摄食而进入人体的，使人由细菌通过摄食而进入人体的，使人体患感染性或中毒性的一类疾病。属体患感染性或中毒性的一类疾病。属食源性疾病范畴，主要包括食源性疾病范畴，主要包括细菌性肠细菌性肠道传染病道传染病和和细菌性食物中毒细菌性食物中毒细菌性肠道传染病 属我国法定传染病，主要包括属我国法定传染病，主要包括霍乱、霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒痢疾、伤寒、副伤寒及新近参照传染及新近参照传染病管理的由病管理的由肠出血性大肠埃希菌肠出血性大肠埃希菌O157O157引起的出血性肠炎引起的出血性肠炎细菌性食物中毒 人体摄入了被细菌或其毒素污染的食人
9、体摄入了被细菌或其毒素污染的食品后所出现的品后所出现的非传染性急性、亚急性非传染性急性、亚急性疾病疾病各类样品采集方法（1） 粪便、肛拭：粪便标本应尽量在病程早期和治 疗前采集，同时应采集新鲜粪便，选取有脓血、 粘液部分3-5克、水样便取含絮状物的2-5ml，盛 于无菌容器中及时送检。若无法获得粪便时，可 用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4-5cm 深处（小儿2-3cm），轻轻转动一圈，擦取直肠表 面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送 检。注意为保证多个检验项目的开展，同一病人 应至少采集2 2支肛拭支肛拭 各类样品采集方法（2） 呕吐物：直接放入无菌容器中及时送检 咽拭样品：采集
10、时应将棉签檫拭咽喉及扁 桃体红肿处（特别是白膜处），然后将棉 签插入4-5ml生理盐水中，尾部弃去 血液：采集患者急性发病期（3天内）和恢 复期（2周左右）各3ml全血分离血清送检 检验项目 霍乱弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、沙门菌、变形杆菌、致泻性大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠耶尔森菌、志贺菌、溶血性链球菌及单核细胞增生李斯特菌引起的食源性突发事件的样品检验 细菌性食源性疾病的检验宗旨 竭尽全力尽快找到病原体 快速、准确 可与传统方法不一定完全相同 检验程序 1 . 样品采集 2. 初步检验活菌数、直接镜检(涂片染色镜检)3. 分离培养 (包括增菌培养和直
11、接平板培养)4. 初筛试验5. 纯培养6. 全面鉴定直接涂片染色镜检 观察存在于检品中特种形态的细菌如霍乱弧菌、弯曲菌，为进一步的检验提供有用的信息 检样的处理 病源检样因含较多病原菌而一般 无须做预增菌处理，但若病源检 样为服过抗生素后采集的检样应 按检验项目要求而进行预增菌处 理以保护和放大目的病原菌 直接插入2ml TSB管37预增菌 46h 直接培养 将无须做增菌处理的病源检样按检验项目要求直接接种于各相应培养基 增菌培养及接种 将预增菌处理后的服过抗生素后采集的病源检样按检验项目要求接种各相 应增菌液培养 增菌培养后接种于各相应培养基 初筛试验 克氏双糖/三糖铁/肠道综合发酵管1、管
12、2PCRVIDAS 可疑菌的鉴定 全面生化试验（APIAPI、ATBATB、VETIKVETIK、IDSIDS、SWFSWF、手工鉴定手工鉴定等） 噬菌体试验 血清分型 毒素或毒素基因测试 毒素或毒素基因测试 霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、EIEC 侵袭毒素、ETEC肠毒素按国标方法进行动 物试验或酶联免疫试验（VIDAS等） 毒素基因测试：霍乱弧菌肠毒素、葡萄球 菌肠毒素、致泻性大肠埃希菌的所有毒力 基因均可用PCR检测，特别是对致泻性大肠 埃希菌的定论应以毒素或毒素基因为准 患者血清的试验 疑似伤寒或副伤寒的患者应取发病一周的血清做肥达氏反应，用作辅助诊 断 将患者急性期和恢复期的血清做
13、凝集效价的对比，4倍增长可确诊检验结果的判定 应以找到病原体或其毒素为最终结论，在此之前所有的快速检验方法如 PCR、VIDAS等得到的结果仅供参考 应注意非病源检样与病源检样检出的 病原体的统一性 检验结果的判定原则（1） 多数患者样品中检出的致病意义明确致病意义明确的细菌在种类、生化和/或血清型、毒素型均一致时，可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体检验结果的判定原则（2） 非病源检样与病源检样检出占绝对优势绝对优势但 通常致病意义不甚明确致病意义不甚明确的细菌如大肠艾希 菌、溶藻弧菌等，且其在种类、生化和/或 血清型均一致，同时本次细菌性食源性疾 病事件中非患者对照标本中未检出该菌时 ，应
14、做该菌的毒素、毒素基因或动物试验 ，阳性结果可报告为细菌性食源性疾病事 件的病原体病原体检验结果的判定原则（3） 样品中检出的生化、血清符合致泻性样品中检出的生化、血清符合致泻性 大肠艾希菌、金黄色葡萄球菌大肠艾希菌、金黄色葡萄球菌，一定，一定 要以要以毒素、毒素基因测试阳性毒素、毒素基因测试阳性为最终为最终 结论报告结论报告 蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌在非病源检样中须达到在非病源检样中须达到 10105 5cfucfu/g(ml)/g(ml)以上者才有报告价值以上者才有报告价值 细菌检验重要筛检试验 接触酶试验 氧化酶试验氧化酶试验氧化酶试验用于分辨用于分辨GG- -杆菌中肠杆菌科及弧菌科两类细菌杆菌中肠杆菌科及弧菌科两类细菌 革兰阴性杆菌阳性反应弧菌科阴性反应 肠杆菌科接触酶试验接触酶试验用于分辨葡萄球菌及链球菌用于分辨葡萄球菌及链球菌阳性反应葡萄球菌革兰阳性球菌阴性反应链球菌接触酶接触酶-+沙门菌检测沙门菌检测概况 1880年发现，至今已有2600种 有动力（除鸡-雏沙门菌） 大多产H2S （除副甲伤寒沙门菌等） 产酸大多产气（除伤寒、鸡-雏沙门菌） 靛基质-、蔗糖-、乳糖- 甘露醇+ 符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原 +、氧化酶-）沙门菌的初筛q肠道综合发酵管1：甘露醇（上斜面）+葡萄糖
