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1、定义：指运用生物化学的理论、方法 和技术，从动、植物等生物体中提 取分离的天然活性物质，以及这些 物质及其衍生物的化学合化、半合 成和现代生物技术制得的产品。生化药物分析常测定：氨基酸及其衍生物、药用活性多肽、药用 蛋白、药用酶、辅酶、核酸及其降解产物和衍 生物、多糖和脂类药物、基因工程DNA重组药物 等。优点：易被机体吸收，针对性强，疗效可靠，毒 副作用小，营养价值高等。一、生化药物分析的特点1、分子量不确定性(1)只有氨基酸、核苷酸、辅酶、甾体激素等化学结构明确的小分子化合物，分子量确定。(2)大多分子量不确定，结构不确定因此，生化药物常需进行纯度及分子量测定。2、分析项目的特殊性(1)除
2、采用理化法分析外,尚需用生物 检定法进行检定,以证实其生物活性(2)因易引入杂质，常需做热源、热 敏、异常毒性、安全性试验(3)多用含量测定表示主药含量，但酶类需进行效价/酶活力测定，来表示有效成分含量。3、分析方法的多样性如：理化、生化、生物检定法等。二、生化药物分析的方法1、鉴别(1)化学反应法(2)UV(3)酶法：如尿激酶-蛋白水解酶(4)电泳法：如肝素-糖凝胶电泳法(5)生物法：利用生物体进行试验2、杂质检查(1)一般杂质(2)特殊杂质3、安全性检查(1)热原检查：由微生物所分泌的某一种代谢产物，一般以为是内毒素，能使恒温 动物体温升高。方法：家兔法/鲎试剂(2)异常毒性试验用一定剂量
3、药物按指定的操作方法和给药途径给规定体重的试验动物，观察其 急毒反应(是否死亡)，是一个限度试验。异常毒性试验出现：主要取决于供试品在生产中是否引入，可发生异常毒性杂质。(3)过敏试验检异性蛋白试验-引起多种过敏反应轻:皮肤产生红斑/丘疹过敏重:窒息、发绀、血管神经性水肿 血压降低、休克、死亡。(4)降压物质检查指药物中含有能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他物质。来源：用动物脏器/组织制备时，在正常组织中存在。方法：猫/狗血压法检药物中所含降压物质。(5)无菌检查对药物及敷料是否染有活菌的检查。由于许多生化药物不能高温灭菌，故检查此项。4、含量/效价测定表示方法：(1)含量百分比：适
4、用于化学结构明 确小分子/经水解后变成小分子药物。(2)生物效价/酶活力单位表示，适于酶类、蛋白质类。常用方法：(1)酶法(2)电泳法(3)生物检定法(4)理化法(1)酶法酶活力测定法：a.终点法：单酶反应定量法指示酶反应偶联定量法b.取样测定法c.连续测定法酶分析法：a.动力学分析法b.总变量分析法(2)电泳法自由界面电泳法高效毛细管电泳法区带电泳法a.纸电泳法b.醋酸纤维素薄膜电泳法c.聚丙烯酰胺凝胶电泳法d.十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳法(3)生物检定法是利用药物对生物体的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。以药物的药理作用为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过
5、供试 品和相应的标准品或对照品在一定条件下 比较产生特定生物反应的剂量比例，来测得供试品的效价。(4)理化法重量法a.提取法b.挥发法c.沉淀法测定法比色法 UV高效凝胶过滤色谱法a.分离根据有效粒径b.分离在固定比例水液中c.活性蛋白可回收高效离子交换色谱法a.分离根据离子化浓度b.分离盐浓度增大的梯度洗脱法c.分离在阳/阴离子交换间呈现差异大d.柱效中等并具高质量的活性回收三、生化药物分析进展总体向理化/仪器分析发展如：GC、HPLC、UV、TR、质谱、磁共振、 超离技术、放射免疫、酶试剂、酶电极检 测等。另，应用细胞培养，对生化药的活力和效价检测。单克隆体免疫分析技术及基因分析技术，提高
6、检测限量和灵敏度。生物检定技术o第一节 微生物限度检查一、定义o微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。二、检查方法o药品微生物限度检查采用活菌计数，o计数方法包括：o平皿法、薄膜过滤法。一、平皿法o1设备、仪器及用具o 无菌室、超净工作台、恒温培养箱(室)、匀浆仪、恒温水浴 箱、电热干燥箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器、菌落计数器 (JLQ- ST或JLQ-S2型)、显微镜 (1500)、
7、天平 (感量0.1g)、锥形 瓶、研钵 (直径1012mm)、培养皿 (直径90mm)、量筒、 试管及塞子、吸量管 (1mL、10mL)、载玻片、盖玻片、玻璃 或搪瓷消毒缸 (带盖)、大橡皮乳头、小橡皮乳头、无菌衣、无 菌裤、无菌帽、无菌口罩 (也可用一次性物品替代)、接种环、 酒精灯 (乙醇灯)、乙醇棉球、灭菌剪刀及镊子、灭菌称样纸及 不锈钢药勺、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆等。o 玻璃器皿均于160干热灭菌2h或高压蒸汽灭菌12l 20min，烘干备用。一、平皿法o 2试剂o 稀释剂(pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液、0.9%无菌氯化 钠溶液、pH7.0氯化
8、钠-蛋白胨缓冲溶液)、 聚山梨酯80、无菌斯盘80、单硬脂酸甘油 酯、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基 、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 (YPD)。一、平皿法o3试验前的准备o无菌室使用前开启紫外灯和空气过滤装置，至少30min；将所 需已灭菌或消毒的用品按无菌操作技术要求移至无菌操作室； 操作人员按要求穿戴无菌服，进入无菌操作室；操作前，先用 乙醇棉球消毒手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开 口处周围，待干后用无菌的手术剪刀将供试品瓶、盒、袋启封 。启封后先仔细检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉长螨的迹象 ，对肉眼可见疑似者用放大镜和显微镜观察，若证实为生霉、 长螨，即可判定为不合格，无
9、需继续检验。o 检验量：一般供试品的检验量为10g或10mL，化学膜剂为 100cm2，检验时，应从2o个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂不得少于4片。一般 随机抽取不少于检验用量的3倍量供试品。一、平皿法o4药品的预处理o供试液制备若需水浴加温时，温度不超过45， 从制备到加入检验用培养基不得超过o1h。o (1) 液体供试液o一般取供试品10mL，加入稀释剂90mL中，充分 振摇，即可作为l10供试液；含王浆或蜂蜜的合剂 、滴眼剂可以原液作为供试液；油剂可加入适量聚 山梨酯80，再照上法制备成供试液；气雾剂可以 适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀 ，吸取相当于10g或10mL供
10、试品，再稀释至 100mL，作为供试液。一、平皿法o4药品的预处理o(2) 固体、半固体或黏稠液供试品o 一般取供试品 取10g，置pH7.0无菌氧化钠一蛋白胨缓 冲溶液100mL中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后制备成 110供试液。o 非水溶性供试品 取供试品5g (5mL)，加入含溶化的无 菌斯盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物 的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液至100mL，边加边搅拌， 使供试品充分乳化，作为供试液 (120)。也可以取供试品 10g，加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜 容
11、器中，充分振摇，使其溶解，然后加入45左右的pH7.0无 菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL，振摇510min，萃取， 静置，取水层作为110供试液。o。一、平皿法o4药品的预处理o(2) 固体、半固体或黏稠液供试品o 不溶于水的膜剂供试品 取100cm2，剪碎 ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL( 必要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，作为供试液 。o 肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g，置 含pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100mL的锥形瓶内， 于45水浴中，保湿，振摇，使溶解作为供试液 。一、平皿法o4药品的预处理o (3) 含抑菌成分供试品o当供试品对控制菌的检查有干扰时，
12、需根据供试品 的不同情况，适当地进行处理，以消除抑菌成分的 干扰。常用的处理方法有以下几种。o 培养基稀释法 将供试液种入较大量的培养 基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。o 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心 (3 000 r/min)30min，弃去上清液，留底部集菌 液约2mL，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶 性药渣，可先离心(500r/min)5min，取全部上层 液，再进行集菌处理。一、平皿法o4药品的预处理o (3) 含抑菌成分供试品o当供试品对控制菌的检查有干扰时，需根据供试品的不 同情况，适当地进行处理，以消除抑菌成分的干扰。常 用的处理方法有以下几种。o 薄膜过
13、滤法 取规定量的供试液，置稀释剂 100mL中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm 、孔径不大于0.45m0.02m微孔滤膜的过滤器内 ，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50 100mL，取出滤膜备检。o 中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品 ，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试 液。一、平皿法o5细菌总数计数o (1) 供试液制备 按各类制剂制备供试液的 方法制备成110的供试液。o (2) 稀释(10倍递增稀释法) 取23支灭菌 试管，分别加入9mL稀释剂，并取1支1mL灭 菌吸量管吸取110均匀供试液1mL，加入已备 妥的装有9mL灭菌稀释剂的试管中，混匀即成
14、 1100的供试液。以此类推，稀释至o11 000或l10 000。一、平皿法o5细菌总数计数o (3) 吸样 根据供试品污染程度，分别取连续三级10倍稀 释的供试液，一般取110、l100、l1 000三级稀释液检验 。每级稀释液用1mL灭菌吸量管吸取稀释液，分别注入23个 平皿各1mL。另取1支1mL吸量管吸取稀释剂各1mL注入2个 平皿中，作为阴性对照，应不得有菌生长。操作时，应特别注 意每次吸液前必须使稀释液充分混匀，以使菌体充分均匀分散 ，降低测定误差。o (4) 倾注培养基 事先将营养琼脂培养基熔化，冷至低于 45时，注入上述各平皿，每皿1520mL，快速转动平皿使 稀释液与培养基
15、混匀，放置，待凝。一、平皿法o5细菌总数计数o (5) 培养 将已凝固的平板倒置，放入3035培养箱( 室)中，培养48h。o (6) 菌落计数 由于细菌种类繁多，形成的菌落大小、形 状、色泽、透明度等皆因种而异，差别甚大。计数时一般用肉 眼直接计数、标记或在菌落计数器上点计，必要时借助放大镜 或显微镜。不要漏计琼脂层内和平板边缘生长的菌落，并须注 意细菌菌落与药渣或培养基的沉淀物、酵母菌及霉菌菌落的区 别。一、平皿法o5细菌总数计数o (7) 结果报告 菌数报告：选择菌落数在30300 之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数 乘稀释倍数作为报告菌数；若邻近的2个稀释级平均平 板菌落
16、数均在30300之间，计算级间比值，当比值 2时，以2级菌落数的平均值为报告菌落数，比值大于 2但不超过5时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为 报告菌数。当比值大于5时，或高稀释级的菌落数大于 或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应重新验证； 各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均 菌落数乘稀释倍数为报告菌数；如各稀释级平板均无菌 落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，以小于 1乘以最低稀释倍数的值为报告菌数。一、平皿法o 6霉菌总数及酵母菌总数计数o (1) 培养基、稀释剂o 培养基 玫瑰红钠琼脂培养基，酵母浸出 粉胨葡萄糖琼脂培养基 (YPD)。该培养基更适 合于酵母菌生长，故中国药典规定含有王 浆、蜂蜜的合剂用
