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1、慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、一、试剂、耗材及仪器试剂、耗材及仪器1.1 试剂试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Lineclontech632180DMEMGibcoC11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginLife Technologies10099-141Lipofectamine LTX & Plus Reagent invitrogen15338QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN1
2、21431.1.2 试剂配制试剂配制a. 氨苄青霉素储液氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素 10g，加 8ml 超纯水，溶解，定容至 10 ml，过滤除菌，分装，-20保存。b. LB 液体培养基液体培养基称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加 800 ml 超纯水，用 10M NaOH 调节 pH 至 7.0，定容至 1, 000 ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。c. 完全培养基完全培养基把 DEME 培养基与血清按照 9:1(V/V)进行混合。d. 50%PEG6000 溶液溶液称取 125gPEG6000
3、用超纯水溶解，定容到 250ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。e. 4M NaCl 溶液溶液称取 46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到 200ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。f. PBS 缓冲液缓冲液称取 8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加 800 ml 超纯水，调节 pH 至 7.4，定容至 1, 000 ml，分装，高压灭菌(121/20min)，4保存。1.2 耗材耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flaskscorning43063975cm2细胞培养瓶corni
4、ng430641TC表面细胞培养皿，规格：35mmcorning430165TC表面细胞培养皿，规格：60mmcorning430196TC表面细胞培养皿，规格：100mmcorning4302936孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning43065915ml尖底离心管corning43079050ml尖底离心管corning45583 毫升吸管Biologix30-0138A11.3 仪器仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜ThermoForma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUSIX71台式高速冷冻离心机ThermoLEGN
5、D MACH 1.6R小型高速离心机ThermoLEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机ThermoLEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYOMDF-U73V冰箱HaierBCD-290W二、方法二、方法2.1包装细胞准备包装细胞准备2.1.1. 细胞复苏细胞复苏a. 把完全培养基预热至 37；用清洗洁净的 500ml 烧杯盛 300ml 超纯水，然后放入 37水浴锅中，预热至 37（至少需 30min） ；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理） ；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（
6、放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中） ，用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为 1-2 min，如果超过 2 min 仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入 70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；c. 把冻融的细胞立即转移至装有 1ml 预热完全培养基的 15ml 离心管中，混匀，立即加入 4ml 预热完全培养基，混匀；d. 加入 5ml 预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min） ，小心移除上清；e. 加入 6 ml 预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至 T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5
7、% CO2, 37）中培养；f. 24 小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2 细胞培养细胞培养a. 当细胞达到 80%融合时，移培养液，用 PBS 洗涤两次，加入 1ml 胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液） ，加入 6ml 预热 DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min） ，小心移除上清，加入 10ml 预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取 1*106细胞分装入新T75 培养瓶，添加
8、基至总体积为 20ml，置于 37 、5 %CO2 培养箱中培养；每隔 23 天传代 1 次，实验用第 23 代细胞。2.1.3 细胞保种细胞保种a. 冻存液：10DMSO，用血清来配制冻存液。b. 收取细胞：离当细胞达到 80%融合时，换新的完全培养基，第二天，移培养液，用 PBS 洗涤两次，加入 2ml 胰酶消化液（T75 培养瓶） ，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液） ，加入 12ml 预热 DMEM 完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min） ，小心移除上
9、清；c. 加入冻存液混匀，分装 至 2ml 冻存管中，密封后应标记冷冻细胞名称和冷冻日期，然后放入梯度降温盒，置于-80过夜，次晨置于液氮罐中保存。2.2. 质粒中量提取质粒中量提取按照 QIAGEN-Plasmid-Purification-Handbook-April-2012 进行，简要中文说明下：a.收集菌液 30ml 4 度离心 6000 g，15min，彻底弃去上清，加入 4ml Buffer P1，重悬菌体沉淀。b. 加入 4ml Buffer P2 温和地混匀（如果混匀充分，则溶液变蓝） 。室温放置5min。c.加入 4ml Buffer P3 立即温和地混匀（如果混匀充分，则
10、溶液变成无色）, 冰上放置 15min,20000 g，4 度离心 30 min。d. 将上清转移到一新的 50ml 离心管中，20000 g4 度离心 15 min。e. 在 QIAGEN-tip 中加入 4ml 的 Buffer QBT，自然过滤。f.将 4 步所得上清液加入 QIAGEN-tip 中，自然过滤。g. 在 QIAGEN-tip 中加入 2X10ml 的 QC Buffer。自然过滤。h. 在 QIAGEN-tip 中加入 5ml 的 QF Buffer，收集滤液。i.在滤液中加入 3.5ml 的异丙醇，混匀 15000g4 度离心 30min，去上清。j.加入 2ml70%
11、的乙醇，15000g4 度离心 10min，彻底去上清，室温晾干 5-10min。k. 加入 80ul 的灭菌水溶解沉淀，浓度测定。2.3 病毒包装病毒包装按照 Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前 24 小时，把 45 x 106个 293T 细胞传代至 10cm 培养皿中，加入完全培养基至终体积 10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为 8090%；b. 293T 细胞转染前 2 小时换上 9ml 新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀 PLUS Reagent，在 EP 管中
12、加入 15ug 的 DNA 混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为 1：1：1：1)，15ul 的 PLUS Reagent，用 Opti-MEM 定容到 500ul，标记为 Tube 1，温和混匀，室温孵育 5 分钟；d. 充分混匀 Mix Lipofectamine LTX，在 EP 管中加入 45ul 的 Mix Lipofectamine LTX 和 455ul 的 Opti-MEM，标记为 Tube 2，温和混匀； e. 将 Tube 1 的溶液加到 Tube 2 中，温和混匀，室温孵育 5 分钟；Tube
13、 1 (Plasmid DNA)Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)455 l Opti-MEM15 l PLUS Reagent45 l Mix Lipofectamine LTXUp to 500l Opti-MEM500 l Total Volume500 l Total Volumef. 将 1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的 100mm 皿中，边加边摇匀。g. 将细胞放入置于 37 、5 %CO2 培养箱中培养，12 小时后换上新鲜的培养基继续培养
14、。h. 转染后 48-72h，收取培养上清，500g 离心 10min 或利用 0.45 m 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒；2.4 病毒浓缩纯化病毒浓缩纯化a. 把去除细胞碎片和团聚的病毒上清转移至离心管，按照 10ml 的病毒上清加入 2.5ml 的 50%PEG6000 混合；b. 加入 1.064ml 的 4M 的 NaCl 混匀；c. 加入 1.142ml 的 PBS 混匀；d. 4C 下，孵育 1.5h，每 20-30min 颠倒混匀；e. 4C 下，7000g 离心 10min。f.小心移除上清，切勿触动白色沉淀，如果白色沉淀出现松动，可以在 7000 g 下短暂离心；g
15、. 加入原病毒上清 1/200 to 1/100 体积的 PBS 重悬沉淀病毒粒子；h. 立即对浓缩纯化的病毒粒子进行滴度测定，并分装后（50-100ul/管）冻存于-80C 超低温冰箱中；2.5 病毒滴度测定病毒滴度测定a. 感染前 24 小时，把 1x 105个/孔 293 细胞传代至 96 孔板中，加入完全培养基至终体积 200ul；b. 把上述重悬的病毒粒子进行 10 倍梯度稀释，共 12 个梯度，用含 4 g/ml polybrene 的完全培养基进行稀释； c. 然后把 90ul 梯度稀释的病毒加入提前接种 293 细胞的 96 孔板中，培养液终体积为 90ul，感染 24 小时后
16、移除旧完全培养基，加入 200ul 完全培养基；d. 48-72 小时后进行绿色荧光观察；如果稀释梯度为 109的病毒感染细胞，48小时后具有绿色荧光的细胞的个数为 4，则细胞浓度为 4*109 cfu/ml。如此类推。2.6 病毒检测病毒检测a. 感染前 24 小时，把细胞传代至 35 mm 平皿中，加入完全培养基至终体积3ml，培养过夜，感染时，细胞密度为 8090%；b. 把冻存于-80C 的病毒取出并在室温下冻融；c. 用新的完全培养基更换培养液，并加入冻融的病毒粒子（MOI 为 5-10）和polybrene（4 g/ml） ，培养液终体积为 3ml；d. 感染 8-24h 后，用新 3-4ml 新完全培养基更换感染培养液；e. 感染 48 小时后收取细胞进行 QPCR 检测，感染 72 小时后收取细胞进行WB 检测；
