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1、南华大学硕士学位论文甲基莲心碱增强环磷酰胺治疗Lewis肺癌作用的研究姓名：李高峰申请学位级别：硕士专业：肿瘤内科学指导教师：庄英帜20030501M D RM D R lg e n eP g pT o p o I IG S TM R PL R PA p oC C BN e fV e rC sAL e w i SLCP IF C MD A BC T XV e r aA L TA S TB U NC rL D H主要英文缩略语索引m u l t i d r u gr e s i s t a n c em u l t i d r u gr e s i s t a n c e1g e n eP 9
2、1 y c o p r o t e i nt o p ois o m e r a s eI Ig l y t a t h i o n eS - t r a n s f e r a s em u l t i d r u gr e s i s t a n c ep r o t e i nl u n gr e s i s t a n c ep r o t e i na p o p t o s i SC a l c i u mc h a n n e l yB l o c kn e f e r i n eV e r a p a m i1C y l o s p o r i n eAL e w isl u
3、n gc a n c e rP r o p i d i u mi o d i d ef l o wc y t o m e t r yd i a m i n ob e n z i d i n eC y c l o p h o s p h a m i d eV e r a p a m i1a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s eb l o o du r e an i t r o g e nC r e a ti n i n eL a c ticd e h y
4、 d r o g e n a s e多药耐药性多药耐药1 基因P 糖蛋白拓扑异构酶I I谷胱甘肽s 一转移酶多药耐药相关蛋白肺耐药相关蛋白凋亡钙通道阻滞剂甲基莲心碱维拉帕米环孢霉素AL e w i S 肺癌碘化丙啶流式细胞仪二氨基联苯环磷酰胺维拉帕米谷草转氨酶谷丙转氨酶血尿素氮肌酐乳酸脱氢酶李高峰南华大学硕士学位论文甲基莲心碱增强环磷酰胺治疗L e w is 肺癌作用的研究研究生：李高峰 导师：庄英帜教授摘要目的；研究甲基莲心碱增强环磷酰胺治疗L e w i s 肺癌的作用及机制，为开发中药来源、毒副作用小的化疗增敏新药提供实验依据。方法：将引进的L e w i s 肺癌荷瘤小鼠的瘤组织制成单
5、细胞悬液，接种于C 5 7 B L 6 J 实验小鼠的右下肢的皮下，建立L e w i s 肺癌模型；随机分组，设环磷酰胺( C T X ) 联合维拉帕米( V e r a ) 及甲基莲心碱( N e f ) 高、中、低三个剂量组，环磷酰胺联合生理盐水( N s ) 组，单用甲基莲心碱中剂量组，溶媒对照组，另设正常小鼠组共8 组，接种后第6 天至1 6 天，隔天给药，第2 8 天处死全部小鼠，测瘤重评价瘤重抑制率，肉眼观察记录肺转移结节数；取血清测A L T 、A S T 、B U N 、C r 、L D H ；行病理切片在光镜下观察肿瘤形态学改变，免疫组化测p 5 3 、b c l 2 、B
6、 a x 蛋白表达，流式细胞术检测原发灶瘤细胞凋亡。结果：1C T X ( 1 0 0 m g k g ) + V e r a ( 1 2 5 m g k g ) 、C T X + N e f ( H ) ( 6 m g k g ) 、C T X + N e f ( M ) ( 3 m g k g ) 、C T X + N e f ( L ) ( 1 5 m g & g ) 、C T X + N s 组的原发肿瘤重量分别为1 4 4 ：t ：0 2 9 、1 4 7 士0 5 4 、2 2 7 a ：0 9 8 、2 8 3 士0 8 63 0 3 = t = 0 4 6 ( g ) ，较N
7、s + N s组7 3 8 士1 5 2 ( g ) ，显著降低( p O 0 5 ) ，C T X + V e r a 、C T X + N e f ( H ) 、C T X + N e f ( M ) 、C T X + N e f ( L ) 、C T X + N s 组及N s + N s组的L D H 分别为1 3 3 0 - 士1 3 4 、1 4 3 9 士4 0 8 、1 4 6 8 士8 6 、1 6 9 4 士2 8 9 、1 7 5 4 i 1 1 2 、4李高峰南华大学硕士学位论文1 8 3 3 士5 3 ( m m o l 1 ) ，在各实验组均无差异( p 0 0 5
8、 ) ；3c T x + v e r a 、C T X + N e f ( H ) 、C T X + N e f ( M ) 、C T X + N e f ( L ) 、c T x + N s 、N s + N e f ( M ) 、N s + N s 、N o r m a l 组的原发灶瘤细胞凋亡率分别为5 4 9 、5 3 5 、3 2 2 、2 8 7 、2 5 9 0 、7 1 、5 6、5 6 ，C T X 与不同剂量的N e f 合用较C T X + N s 及N s + N s 组均显著增加( p O 0 5 ) ：T h e r ew e r en od i f f e r e
9、 n c e si nL D H ( p O 0 5 ) ：3A p o p t o s i Sr a t e so ft u m o r sf r o mC T X + V e r a 、C T X + N e f ( H ) 、C T X + N e f ( M ) 、C T X + N e f ( L ) 、C T X + N sw e r e5 4 9、5 3 5 、3 2 2 、2 8 7 、2 5 9 0 、7 1 、5 6 、5 6 r e s p e c t i v e l y T h e r ew e r em a r h e dd i f f e r e n c e sb
10、e t w e e nC T X + N e fg r o u p sa n dC T X + N so rN s + N s ( p l 时，袋示两蓊有协同作用。5 石蜡切片制备取材，1 0 的福尔马林浸泡，梯度酒精脱水，透明浚蜡，龟埋，切片4 u m ，H E染色，脱水透骥，中性树胶封片。6 免疫组化测p 5 3 、b o I - 2 、B a x 蛋白袭达将荔蝤切嚣索援黢蜡后，按s P 试剡盒说明书操终：每张甥片鸯妥：i 建氧化瓣阻断剂5 0 u l 作用l O m i n - - P B S 洗3 次5m i n - 嘞D 入非免疫性动物血清5 0 u l ，室滋瓣弯5 避n 一鸯彝入
11、一摭5 0 u l ，4 过攫- P B S 洗3 次X m i n - J J n 入二抗5 0 u l ，孵育1 0m i n 一加入链霉菌抗生索过氧化酶液5 0 u l ，室温孵育i 0m i n - * P B S 洗3次x 5 辩i n 一翔入D A B I O O u l 显毪5 臻i n 一苏本繁复染一鑫来承冲洗，灏精脱永，= 甲苯透明，中性树胶封片一光镜观察，对照组不加一抗，其余步骤相同。细隗核( p 5 3 ) 、细脆浆翻或细施膜( b c l 一2 、B a x ) 被染成棕黄识为阳佼细脆，糟细胞图象分析仪分析蛋臼表达爨，在2 0 倍物镜随枧测爨1 0 0 - 2 0 0
12、个阳性细胞的光密度( m e a no p t i cd e n s i t y ，M O D ) 和阳性磷积相对比( p o s i t i v er e l a t i v ea r e a ) ，以两者的乘积( M O D x a r e a ) 反应蛋是畿达量。7P l 染色流式细胞仪检测原发灶瘤细胞凋亡将冬处理缀瓣瘗缀织建匀浆法裁戒荦缨稳繇滚，纲越数约i 0 8 - i 0 7 令，P B S洗3 次，5 0 0 r p m X1 0m i n 离心去上清，加7 5 的酒精固定，放入冰盒中送检。士穰蘸溱誉；P B S 洗1 次5m i n ；翔P I 袋蠢染毪渡( 5 u g m l
13、P I ，2 0 u g m lR n a s e A )乎4 。C 冰箱中放援4 5m i n ；3 0 0 酗尼龙网滤过。计数1 0 0 0 0 个细胞，检测细胞周麓及凋亡。8 统计学处理采用x 士S ，最小显蔫差法( L S D 法) ，将数攒输入S P S S I O 0f o rw i n d o w s 统计软件中分析，P O 0 5 ) ，说明了单用甲慕莲心碱对L e w i s 齄癌无效，逶避C T X 会爆N e f 套刹量缀及合鼹V e r a p a m i l 缎与C T X + N s 组比较，发现除N e f ( L ) 外，V e r a p a m i l 、N
14、 e f ( H ) 、N e f ( M ) 组的肿瘤重量均骞下降( p e 0 5 ) ( 冤表l 圈1 ) 。C T X + V e r a1 4 4 士0 2 9 81 9 。5 C T X + N e f ( H )1 。4 7 + 0 5 4 41 9 9 2 C T X + N e f ( M )2 2 7 * 0 9 8 43 0 7 6 C T X + N e f ( L )2 ，8 3 士0 8 6 43 8 3 5 C T X + N s3 。0 3 圭0 。4 6 。4 1 0 5 N s + N e f ( M )6 8 8 士1 1 09 3 2 2丛墨醚曼Z ：曼
15、墨圭! ：主至：。! Q Q ：Q Q袅，bv s c ，dp O O 嚣C T X + ￥e r aC T X + N e f 釉C T X + N sN S + N SC T X + N e f i ( mc T x + N e f ( DN s + N e f0 1 )组别图1N e f 对L e w i s 肺癌的原发肿瘤重量的影响Hoo藿go李高峰南华大学硕士学位论文1 2 甲基莲心碱合用环磷酰胺对L e w is 肺癌自发- 性肺转移的影响加用C T X 的各组自发性肺转移结节数较溶媒组( N s + N s ) 及N s + N e f ( M ) 组的均有显著减少( p 00
16、5c t x + v e r aC T X + N E F ( M )c t x + n sN S + N SC T X + N E F ( H )c r X + N E F ( 1 )n s + n e f ( M )组别图2 N e f 合用C T X 对L e w i s 肺癌小鼠的自发性肺转移的影响1 3N e f 对C T X 治疗L e w i s 肺癌增敏作用分析表3 可见，V e r a 、N e f ( H ) 、N e f ( M ) 、N e f ( L ) - 与C T X 合用均具有协同作用( q 1 ) ，其中V e r a 与N e f ( H ) l 拘q 值相近，表明N e f ( H ) l i p6 m g k g 与V e r a l 2 5 m g k g 的化疗增敏作用相当( 见表3 ) 。1
