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1、第二章 蛋白质研究技术第一节 蛋白质的分离纯化第二节 蛋白质的鉴定第三节 蛋白质的检测第四节 蛋白质的结构分析第一节 蛋白质的分离与纯化一个哺乳动物细胞大约含有 10,000 种蛋白质。要研 究它们的结构与功能，首先要把它们分离、纯化出 来但由于蛋白质在大小、带电性、水溶性等方面的差异 ，没有一种方法能够分离所有的蛋白质本节首先讨论蛋白质分离、纯化的常规方法和技术， 然后介绍膜蛋白（membrane protein ）的分离蛋白质分离纯化的基本原则v 选择好的材料v 摸清目的蛋白质的稳定性v 探索有效的抽提法和浓缩法v 建立一套层析的组合v 以较好的方法贮存贮存蛋白质分离纯化的方法粗提： 盐析
2、 有机溶剂沉淀 结晶 等电点沉淀精提 ： 离心（centrifugation） 电泳（electrophoresis） 层析（chromatography） 离心（centrifugation）原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子） 有不同的分子量（mass）或密度（density），因此离 心时有不同的速率q 不同的蛋白质分子量差别很大，但密度差别很小。 蛋白质的平均密度是 1.37 g/cm3。 除非蛋白质结合了脂 或碳水化合物，蛋白质之间密度的差异不会超过 15%q 离心力由转速和从转子中心到蛋白质界面的距离决 定离心（centrifugation）q 沉降系数（sedimenta
3、tion constant）与蛋白质的密度 和形状有关，也与介质的密度和粘度有关q 离心可用于两个方面：作为一种分离技术从混合物中分离一种成分作为一种分析技术测定物质的物理性质，如分子 量，密度，形状及平衡结合常数（equilibrium binding constants）离心（centrifugation）. 差速离心（differential centrifugation）. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation）. 差速离心（differential centrifugation）用于从组织匀浆中把可溶性的 蛋白质与细胞的不溶性成分分开离心后，蛋白质留在上清
4、 （supernatant）中，其他成分形 成沉淀（pellet）差速离心（differential centrifugation）采用不同的 速度和时间 可以分离不 同的细胞结 构速度 时间. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation） 用蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度带 高速离心机（ 40,000 r/min） 被分离的物质分布在相应的密度带内 时间应控制好： 太短，不能充分分离太长，所有的物质都沉 淀到离心管底部蔗糖梯度 不能用于精确测定分子量，因 为蛋白质的形状差异也影响沉 降率 一次分离许多不同类型聚合物 或颗粒的最有效方法平衡密度梯度离心（equilibri
5、um density-gradient centrifugation）： 用 于分离 DNA 和细胞器速率区带离心（rate-zonal centrifugation） 电泳（electrophoresis）物质在电场中移动的速度由电荷 质量比决定用于分离小分子，如氨基酸、核苷酸. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE ）. 等电聚焦 （isoelectric focusing ，IEF ）. 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）. 脉冲电泳（pulsed-fi
6、eld gel electrophoresis）电泳（electrophoresis）. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS- polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝胶 凝胶由丙烯酰胺（acrylamide）单体通过交联剂亚甲 双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成 凝胶孔径可以通过选择不同浓度的丙烯酰胺和亚甲 双丙烯酰胺进行控制 凝胶有分子筛效应SDS -PAGESDS（sodium dodecylsulfate） 一种阴离子洗涤剂，几乎能破坏 天然蛋白质中所有的非共价键，从 而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，
7、消除了蛋 白 质形状对迁移率（migration rate）的影响 SDS 以 1:2 的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋 白 质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽 链 长度）成正比。所以分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因 素SDS -PAGE SDS-PAGE 分离的蛋白质 可以用 Coomassie blue 染 色，也可银染（silver stain ） SDS-PAGE 能分离分子量 差异小于 10% 的蛋白质 用于蛋白质纯化和分子量 近似值测定. 等电聚焦（isoelectric focusing ，IEF ） 在凝胶上将一种两性电解质（ampholyte）混合
8、物进 行电泳，形成连续的 pH 梯度 每一种蛋白质停留在与其等电点（pI）相同的位置 IEF 产生三种效应：浓缩效应，分子筛效应和电荷效 应 IEF 能分离 pI 值仅相差 0.01 的蛋白质（即一个净电 单位）. 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）分离分子量差异很小的蛋白质双向电泳 = IEF + SDS-PAGE 第一向：根据电荷差异用 IEF 分离第二向：根据分子量差异用 SDS- PAGE 分离双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）IEFSDS-PAGE双向电泳（two-dimensional
9、gel electrophoresis）每一个点代表一条多肽链，每一条多肽 链有自己的等电点和分子量。多肽链可 以用染色法或放射自显影进行检测. 脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis） 用于分离大片段 DNA（20 kb10 Mb） 有电场存在时，大片段 DNA 以伸展的 方式进行移动 停止通电，DNA 分子卷曲成不规则形状。 DNA 从伸展到卷曲所需要的时间与其长度成正比 然后改变电泳方向 90或 180再次通电如此反复进行，逐步把不同大小的 DNA 分开 层析（chromatography）原理：溶液中的 分子能与固体表 面进行结合及解 离，但由于蛋白
10、 质在分子量、带 电性和结合特异 性方面的差异， 与固体表面结合 与解离的难易程 度不一样，所以 流动的速度也不 一样固定相由圆球形 小株紧密堆积而 成。这些小株的 性质决定了可以 分离哪种成分流动相固定相层析（chromatography）. 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography ） . 离子交换层析（ion-exchange chromatography） . 亲和层析（affinity chromatography）. 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography ） 分离分子量有差异的蛋白质 多孔小株由聚丙烯酰胺（poly
11、acrylamide）、葡聚糖（ dextran）或琼脂糖（agarose） 组成 小分子能进入小株内部，而大 分子被排阻在外部，因此小分 子在层析柱中流动速度慢，从 而把混合物按不同分子量分开 可根据洗脱体积（elution volume）估计蛋白质分子量分子量大 洗脱体积小大分子小分子葡聚糖小株凝胶过滤层析（gel filtration chromatography ）. 离子交换层析（ion-exchange chromatography） 分离所带电荷不同的蛋白 质 离子交换树脂分为两种：阳离子交换树脂（anion exchange resin）和阴离子 交换树脂（cation exc
12、hange resin）,如 DEAE -cellulose 和 CM-cellulose 不同的蛋白质与树脂有不 同的亲和力，因而可用不 同盐浓度或 pH 值的 buffers 洗脱洗脱示意图结合 洗脱曲线离子交换层析（ion-exchange chromatography） . 亲和层析（affinity chromatography） 利用蛋白质与与其他分子的结合特异性 小株与配体共价结合 配体可以是抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似 底物、抗体或其他物质（如外源凝集素、燃料及金 属离子等） 与配体特异结合的蛋白质被滞留在层析柱中，其他 成分流出 加入过量的配体或改变盐浓度（或 pH）使
13、结合的蛋 白质流出亲和层析（affinity chromatography）膜蛋白的分离v 蛋白质从质膜中分离时，暴露出来的疏水区相互作用 ，引起蛋白质聚集、沉淀v 去污剂（detergents）是一种两亲分子，能嵌入到磷脂 双层（phospholipid bilayers）中，破坏质膜。其疏水部 分与烃基结合，亲水部分与水结合，因此可以增溶（ solubilization）脂和蛋白质v 去污剂包括两类：离子型（ionic detergents）如脱氧胆 酸钠、十二烷基硫酸纳 非离子型（nonionic detergents）如 Triton X-100、辛基葡萄糖几种去污剂v 低浓度时，去污
14、剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的 增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）v 微团是小的、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分 向内临界微团浓度（critical micelle concentration）：去污剂开 始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数v 离子型去污剂除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还 能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电， 所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键, 使蛋白质变性v 非离子型去污剂在不同的浓度有不同的作用方式浓度较高（ CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形 成微团浓度较低（CMC）时，虽然不形成微团，但仍 能与大部分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用
15、v大部分膜周边蛋白（peripheral protein）通过 离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因 此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如 Ca2+）结合的试剂进行分离v大多数膜周边蛋白是可溶性的，不能用非离 子型去污剂增溶第二节 蛋白质的鉴定 分子量测定 等电点测定 末端氨基酸残基测 定 蛋白质分子中的糖 链 蛋白质分子中的脂 分子量测定. 渗透压（osmotic pressure）. 沉降平衡（sedimentation equilibrium）. 凝胶过滤层析（gel fitration chromatography）. SDS-PAGE. 激光解吸电离飞行时间质谱（LDI-TOF-MS）. 渗透压（osmotic pressure）公式：/ c = RT / M + K c ：渗透压 c：溶质浓度 R：气体常数 T：绝对温度 M：分子量 同时测定几个不同浓度的渗透压，以/ c 对 c 作图并 外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出 M 为避免 pH 值的影响，在溶解度允许的范围内，尽量 采用等电点或接近等电点的缓冲液，并增高溶液中 无机盐的浓度 可以测分子量在 10,000 至10,0000 范围的蛋白质 实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白 质分子是否均一. 沉降平衡（sedi
