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1、185 860 了At h e s i ss u b m i t t e d t oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fM a s t e rE f f e c t so fP r o s t a g l a n d i nE lO i lP K Ca n dH S P 7 0i nI s c h e m i a R e p e r f u s i o nP r e c o n d i t i o n i n gM y o c y t eB yZ h a n gY a n x i aS u p e r v i
2、s o r ：P r o f F uR u n f a n gP h a r m a c o l o g y一一T h eb a s i cM e d i c a lC o l l e g eM a y2 0 1 0原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据
3、郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日郑州大学硕士学位论文P G E 。预处理对缺血再灌注心肌P K C 及H S P 7 0 表达的影响中文摘要前列腺素E 1 预处理对缺血再灌注心肌P K C 及H S P 7 0 表达的影响研究生：
4、张艳侠。 导师：付润芳教授郑州大学基础医学院药理教研室河南郑州4 5 0 0 0 1摘要随着冠脉搭桥术、溶栓疗法以及心脏外科体外循环术等方法在临床工作中的广泛开展，心肌缺血再灌注损伤成为亟待解决的问题。P G E l 具有抑制血小板聚集、血栓素A 2 生成、动脉粥样硬化、脂质斑块及免疫复合物形成的作用。P G E l能扩张外周血管和冠状血管，降低外周阻力和血压，有保护缺血性心肌，缩小心肌梗死面积等作用。导师组以往的研究已经证实，P G E l 可以改善心肌细胞的超微结构变化和功能障碍，缩小心肌梗死范围，改善血流动力学，减轻再灌注心肌心律失常的发生，减轻缺血再灌注心肌细胞内钙超载，提高大鼠心肌抗
5、氧化酶的水平，减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤时脂质过氧化程度，抑制细胞凋亡。然而，对P G E I 预处理在离体大鼠心肌缺血再灌注损伤中P K C 所介导的信号转导机制及其与H S P 7 0 之间的联系，尚未见报道。因此，本实验通过w e s t e r n b l o t技术测定P K C 的含量、免疫组化法测定H S P 7 0 的表达，探讨P K C 信号转导通路在P G E l 预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用，为P G E l 作为药理性预适应的有效药物在防治心血管疾病方面的广泛应用提供理论依据。目的：采用大鼠L a n g c n d o r f f 离体灌流装置制备心肌缺
6、血再灌注损伤模型，探讨P G E l 预处理对大鼠缺血再灌注心肌P K C 及H S P 7 0 的影响，以揭示P G E l 预适应在心肌细胞内所介导的信号转导途径，进一步阐明其防治心肌缺血再灌注损伤的作用机制。郑州大学硕士学位论文P G E ，预处理对缺血再灌注心肌P K C 及H S P 7 0 表达的影响中文摘要方法：实验共分为五组，每组8 只大鼠，分别为正常对照组，缺血再灌注组和P G E 小、中、大剂量( 1 4 I - t g L 、4 2p g L 、1 2 6 , g L ) 预处理组：先用正常台式液平衡灌流1 5 r a i n ，正常对照组继续用正常台式液灌流9 0 m
7、i n ；缺血再灌注组用正常台式液灌流3 0 m i n 后停灌3 0 m i n ，然后再灌3 0 r a i n ；各P G E l 预处理组( 1 4 9 9 L 、4 2p g L 、1 2 6p g L ) 以正常台式液平衡1 5 r a i n 后换用含P G E l 的正常台式液灌流3 0 r a i n ，停灌3 0 r a i n ，正常台式液再灌3 0 r a i n 。H E 染色制各病理切片，观察大鼠心肌纤维病理形态学变化；采用w e s t e r n - b l o t 技术，半定量检测心肌细胞内P K C 表达量的变化：采用免疫组化法测定H S P 7 0 的表达
8、变化。结果应用S P S S l 7 0 软件统计处理数据，以均数标准差( x ：is ) 表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准0 t = 0 0 5 。结果：1 心肌纤维形态学变化光镜下观察，正常对照组心肌纤维完整，染色均匀，排列整齐紧密，形态规则，间质未见血管扩张和炎细胞浸润；缺血再灌注组大范围心肌纤维断裂、肿胀，结构紊乱，局部呈波纹状改变，间质血管可见明显扩张，有大量炎细胞浸润；P G E l 各预处理组均有不同程度的改善，P G E l ( 1 4 p g L ) 预处理组心肌纤维肿胀、排列紊乱，间质仍有血管扩张和炎细胞浸润，程度较缺血再灌注组稍有减轻；P G E l ( 4 2
9、 9 9 L ) 预处理组心肌纤维肿胀，但少有断裂，间质血管扩张不明显，有少量炎细胞浸润；P G E l ( 1 2 6 I t g L ) 预处理组心肌纤维肿胀明显减轻，无断裂，偶见炎细胞浸润，形态近似于正常对照组。2P G E l 预处理对大鼠缺血再灌注心肌P K C 的影响蛋白激酶C 在缺血再灌注组的表达( 0 3 8 3 士0 0 1 3 ) 较正常对照组( 0 2 2 0 j ：0 0 0 3 ) 增加。与缺血再灌注组相比较，各剂量P G E l 预处理组( 1 4 9 9 L 、4 2 9 9 1 、1 2 6 I - t g L ) 的心肌组织P K C 的表达量亦明显增加( P
10、 1 5 U L - 1 作为心肌缺血损伤的诊断标准【4 5 1 ，随发病时间延长，该比值逐渐升高，对I R I 的早期及晚期诊断均有价值。导师组以往研究】发现：P G E l 可提高纯化培养的缺氧复氧乳鼠心肌细胞S O D 和线粒体L D H 活性。李卫国【4 7 】等通过对3 2 例心脏瓣膜病、先天性心脏病房间隔缺损( A S D ) 和室间隔缺损( V S D ) 患者的研究发现：P G E l 应用于体外循环后心肌肌钙蛋白I ( c T n I ) 和C K - M B 含量降低。改善心肌形态学变化。马香芹等对培养的乳鼠心肌建立缺氧复氧模型，心肌细胞电镜超微结构观察【4 6 】显示：缺
11、氧复氧损伤组的多数细胞胞浆减少，核深染，固缩，染色质不均匀有边集现象，P G E l 高中低剂量组多数细胞结构接近正常，少数有染色质轻度边集。提高机体抗氧化活性，减少氧自由基的生成，减轻钙超载。有研究【4 9 】表明，P G E l 可使缺血再灌注心肌S O D郑州大学硕士学位论文P G E ，对缺血再灌注损伤心肌的保护作用文献综述活力明显增高，M D A 含量降低，G S H - P x 活性升高。T a m u r a 5 0 】等的实验结果同样也证实P G E l 可以抑制氧自由基的产生，减轻缺血再灌注组织脂质过氧化损伤。冯国清【l5 】等研究结果显示，P G E l 各剂量组心肌组织中
12、C a 2 + 及M D A 含量显著低于模型组，表明P G E l 具有抑制再灌注心肌组织中氧自由基的生成，抑制C a 2 +通道开放，降低再灌注室性心律失常发生的作用。促进G 蛋白的表达，开放钾通道。P G E l 药理性预适应后，、经过结扎左冠状动脉前降支( L 心) 3 0 m i n 和再灌注9 0 m i n 处理后，通过w e s t e r n - b l o t 技术测定G o 正l 1l 的含量，结果显示早期和延迟预适应保护组分别使心肌G a q 1 含量升高，与M I R I 组比较有显著统计学意义【4 3 1 。这提示G O L q 1 1 参与P G E l 对心肌缺
13、血再灌注损伤的保护作用，是心肌预适应保护中跨膜信号转导的重要途径。杨光【5 1 】等采用常规全细胞模式膜片钳方法记录P G E l 对豚鼠心室肌细胞K A l l P 通道的电流，发现P G E l 可使该电流增加，而加入K A T P 通道的特异性阻断剂g l i b e n c l a m i d e 后，可阻断P G E l 引起的增大的K + 电流，所以P G E l 可诱导正常 A T P i 的豚鼠心室肌K A a V 通道开放。可见心肌细胞K A a v 通道在缺血预适应保护机制中的重要作用已受到普遍关注。角灿武【5 2 】等采用全细胞膜片钳技术得出结论：P G E l 预处理促
14、进缺血再灌注心室肌细胞K A T P 通道和I t 0 通道开放，增大I K ( A T P ) 、I t o 电流，并随剂量增加效应增强。抑制细胞凋亡。马香芹【4 5 】等采用原代心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型，从形态学、生化学、分子生物学等方面观察缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡现象及P G E l 对凋亡的影响，结果显示：D N A 琼脂糖凝胶电泳显示模型组D N A 呈明显的非随机降解状态，且在电泳中呈凋f 独有的“梯状图谱”，P G E l 各给药组随剂量的增加，电泳中D N A 的梯状条带逐渐减弱；T U N E L 法检测到模型组心肌细胞有较多的阳性标记，细胞核呈紫蓝色颗粒，而P G
15、E 】( 4 5 9 9 L ) 组只有散在的阳性标记；用原位杂交法检测心肌细胞内b c l 2 、b a xm R N A 的含量，经统计分析可知P G E l 各用药组的b e l 2 、b a xm R N A 的积分光密度值与缺氧复氧损伤组比较均有统计学意义，且b a xm R N A 的积分光密度值与b c l 2m R N A 的积分光密度值呈负相关( r - - 一0 8 6 8 ) ( P 0 0 1 ) ，免疫组化法检测心肌细胞内二者的含量可得到相似的结论。这提示P G E l 能促进抗凋亡基因b e l 2m R N A 的表达，抑制促凋亡基因b a xm R N A 的表
16、达。增加心肌血管内皮生长因子V E G F 蛋白的表达。梗死后机体主要通过自身冠脉扩张和血管再生方式建立冠脉侧支循环。关勤【5 3 】等通过结扎大鼠冠脉左前降支建立大鼠急性心肌梗死A M A 模型，结果显示P G E l 治疗组V E G F 蛋白的表达、毛细血管密度、血浆V E G F 浓度显著增加，明郑州大学硕士学位论文P G E ，对缺血再灌注损伤心肌的保护作用文献综述显高于对照组和假手术组。随P G E l 剂量的增加，V E G F 蛋白水平相应升高。提高内皮型一氧化氮合酶( e N O S ) 活性水平。孙卓【踟等通过结扎大鼠冠脉左室支，用R T P C R 方法检测心尖心肌组织e N O Sm R N A 和诱导型一氧化氮合酶i N O Sm R N A 的变化，通过凝胶图像分析系统对R T - P C R 产物电泳条带进行密度分析，硝酸还原酶法测定血浆N O 浓度，得出结论：P G E l 通过提高e N O S 活性水平而达到对缺血再灌注心
