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1、 第 22 卷 第 11 期2013 年 11 月中国普通外科杂志 Chinese Journal of General SurgeryVol.22 No.11 Nov. 2013版权归中国普通外科杂志所有http:/中国普通外科杂志 , 2013, 22(11):1466-1470.甘草素对人乳腺癌 MCF-7 细胞增殖、凋亡及 自噬的影响陈键1，刘田雨1，俞伟1，肖依楠1，杨雨佳1，蒋碧梅2，涂自智2，肖献忠2（1. 中南大学湘雅医学院，湖南 长沙 410013；2. 中南大学基础医学院 病理生理学系，湖南 长沙 410078）摘 要 目的：观察甘草素对人乳腺癌 MCF-7 细胞生长、凋亡
2、及自噬的作用。 方法：不同浓度（0.05，0.10，0.20，0.40 mmol/L）的甘草素处理 MCF-7 细胞 24，48，72 h 后，采用 MTT 比色法测定细胞存活率。以上浓度的甘草素处理 MCF-7 细胞 48 h 后，用 Hoechst 荧光染色法观察细胞凋亡情况，用吖啶橙（AO）染色，观察细胞自噬。结果： 随着甘草素浓度的增加及作用时间的延长，MCF-7 细胞的存活率不断降低，部分结果与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05；2）与对照组比较，P0.05 vs. control; 2) P0.01 vs. control2.2 甘草素对 MCF-7 的凋亡的影响2.2.1
3、MCF-7细胞的形态学改变 Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态的变化发现，对照组及不同剂量的甘草素处理 MCF-7 细胞后，均可见细胞核出现致密浓染，或呈现碎片状浓染，且药物处理组较对照组明显。随着浓度的增加，致密浓染或碎片浓染的细胞数逐渐增加，呈一定的浓度依赖性（图 2）。ABCDE图 2 甘草素诱导 MCF-7 细胞凋亡的形态学改变（Hoechst33258 染色，40） A：对照组；B：甘草素 0.05 mmol/L； C：甘草素 0.10 mmol/L；D：甘草素 0.20 mmol/L；E：甘草素 0.40 mmol/L Figure 2 The morphologica
4、l changes of MCF-7 cells induced by liquiritigenin (Hoechst 33258 staining 40) A: Control; B: 0.05 mmol/L liquiritigenin; C: 0.10 mmol/L liquiritigenin; D: 0.20 mmol/L liquiritigenin; E: 0.40 mmol/L liquiritigenin第 11 期1469陈键， 等： 甘草素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、 凋亡及 自 噬的影响版权归中国普通外科杂志所有http:/中国普通外科杂志 , 2013, 22(11
5、):1466-1470.2.2.2 细胞凋亡率 所拍得的照片，每组选取20 张，用 IPP 软件处理，计数细胞数和凋亡小体数，并算出凋亡率。结果显示，甘草素能够诱导MCF-7 细胞凋亡。0.05，0.10，0.20，0.40 mmol/L的甘草素处理 MCF-7 细胞 48 h 后，凋亡率分别为 10.67%，13.89%，16.04%，32.48%，而对照组为 8.1%，与对照组相比，0.20，0.40 mmol/L时差异有统计学意义（均 P0.01）（图 3）。2.3 MCF-7 细胞自噬泡的变化用荧光染料 AO 染色， 检测活细胞中自噬泡。在荧光显微镜下观察到，用甘草素处理的细胞中出现很
6、多点状红色斑点的酸性自噬泡。对照组细胞未检测出自噬泡（图 4A）；甘草素浓度处于0.050.20 mmol/L 时（图 4B-D），细 胞 质 中 都出现红色的自噬泡，数量逐渐增多；0.40 mmol/L处理时（图 4E），细胞质中自噬泡数量较前减少。凋亡率（%）40353025201510501)1)0 0.05 0.1 0.2 0.4 甘草素浓度（mmol/L）图 3 不同浓度甘草素对 MCF-7 细胞凋亡率的影响 1）与对照组比较，P0.01 Figure 3 Eff ect of diff erent concentration of liquiritigenin on apoptot
7、ic rate of MCF-7 cells 1) P0.01 vs. control3 讨 论肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病。凋亡又称细胞程序性死亡，是细胞遵循自身基因调控主动自我结束生命的死亡过程。诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗研究的新靶点和抗癌疗法的新的筛选标准，在肿瘤的预防和治疗过程中具有重要意义。自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象。最初，人们认为自噬只是作为一种细胞生存的自我保护机制，在抵抗营养缺乏、清除损坏的细胞器以及抵抗病原体感染上发挥着重要的作用13。然而，近年来越来越多的证据表明，自噬在肿瘤的发
8、生、发展中扮演着重要的角色14。研究者们对此认识不一：有研究15发现，在一些治疗因素下，肿瘤细胞中的自噬活动可以被激活，延缓肿瘤细胞的凋亡速度，从而在早期阶段对治疗起到一定的抵抗作用；也有研究16-17表明，自噬像凋亡一样，具有抗肿瘤细胞生长的作用，过度的自噬可以引发自噬性细胞死亡。目前，自噬在肿瘤发生发展中的这种双重功能，引起了越来越多的研究者们探讨自噬与肿瘤的关系，成为目前肿瘤研究的热点18-19。甘草素是从甘草中提取的一种二氢黄酮单体化合物，大量研究7-9表明，天然植物中存在的某些黄酮类化合物具有较好的抗肿瘤作用，是目前研究的热点。刘长伟10报道甘草素可抑制人宫颈癌 HeLa 细胞的增殖
9、并诱导其凋亡；王宇等20报道甘草素可以抑制人肺腺癌 A549 细胞迁移；高薇6报道，同为黄酮类化合物之一的槲皮素具有诱导人乳腺癌 MCF-7 细胞自噬性死亡的作用。那么甘草素是否可以影响乳腺癌细胞的凋亡及自噬，从而起到抗肿瘤作用？MTT 比色试验检测甘草素对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖的影响发现：不同剂量的甘草素，随着图 4 甘草素诱导MCF-7细胞自噬的观察 （AO染色， 100） A：对照组；B：甘草素0.05 mmol/L；C：甘草素0.10 mmol/L； D：甘草素 0.20 mmol/L；E：甘草素 0.40 mmol/L Figure 4 Observation of autop
10、hagy induction in MCF-7 cells by liquiritigenin (AO staining, 100) A: Control; B: 0.05 mmol/L liquiritigenin; C: 0.10 mmol/L liquiritigenin; D: 0.20 mmol/L liquiritigenin; E: 0.40 mmol/L liquiritigeninABCDE中国普通外科杂志第 22 卷1470版权归中国普通外科杂志所有http:/中国普通外科杂志 , 2013, 22(11):1466-1470.剂量的增加，细胞存活率不断下降；在同一剂量，随
11、着时间的增加，细胞存活率不断下降。Hoechst荧光染色观察甘草素诱导人乳腺癌 MCF-7 细胞凋亡的形态学改变示：随着剂量的增加，致密浓染或碎片浓染的细胞数逐渐增加，并具有一定的剂量效应关系。采用 IPP 软件对凋亡进行定量分析发现：随着甘草素剂量的增加，细胞凋亡率也不断上升，具有一定的剂量效应关系。紧接着，本研究采用吖啶橙染色观察自噬泡变化发现：与对照组比较，实验组细胞的自噬活性明显激活；甘草素浓度处于 0.050.20 mmol/L 时，自噬泡数量逐渐增多，0.40 mmol/L 处理时，细胞质中自噬泡数量较前减少，笔者推断，随着甘草素浓度的增加，自噬活性呈现出先升后降的态势，在 0.2
12、00.40 mmol/L 之间存在一个拐点；在低剂量（0.050.20 mmol/L）时，MCF-7 细胞的生长受抑可能为凋亡和自噬的共同作用，而高剂量（0.40 mmol/L）时，其生长受抑可能主要与凋亡相关，自噬的作用不明显。而凋亡和自噬之间存在依生物学背景而变化的复杂动态关系，目前这种关系尚未被完全认识，有待进一步探讨6, 11, 19。综上所述，甘草素可抑制人乳腺癌 MCF-7 细胞的生长，其生长受抑与凋亡促进及自噬诱导相关。然而，本研究仅仅为甘草素应用于临床抗肿瘤的可能性迈出了第一步，最终能否应用于临床，有待进一步研究。参考文献1 白鸽 . 基于乳腺癌分子分型的个体化治疗进展 J.
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