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1、医学免疫学与免疫学技术实验 贵阳医学院免疫学教研室人血清IgG的提取及鉴定2014-04-22人血清IgG的提取及鉴定离子交换层析法提取人IgG血清IgG鉴定人血清IgG的提取及鉴定离子交换层析法提取人IgG流程：u DEAE-纤维素预处理、采集样品（血清）u 装柱、平衡u 上样和洗脱u DEAE-纤维素再生人血清IgG鉴定 ：u 洗脱液抗原性鉴定琼脂双扩散u 纯度鉴定免疫电泳u 回收率的测定分光光度法u IgG回收量的测定-直接ELISA离子交换层析的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各
2、种离子或 离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离 纯化的层析方式。 离子交换层析的基本过程带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多， 亲和力大的后被洗脱下来。离子交换剂在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。纤维素OCH2COO-Na基质 电荷基团 反离子阴离子交换剂二乙氨乙基纤维素，弱碱性DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）在 pH8.6以下分离中性或酸性物质。人IgG的主要理化性质及DEAE-纤维素提取原理人IgG特性:血清含量：9.5-12.5 mg/ml ；血清中的IgG属 于中性蛋白（pI:6.85-7.5），其余均属酸性蛋白（ pI:4-5 ）。DEAE-纤维素提
3、取IgG原理：在pH7.27.4的环境中，酸性蛋白被DEAE- 纤维素吸附， IgG不被吸附而最早从柱中流出，而得以纯化。实验步骤1、DEAE-纤维素预处理：强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强酸处理 0.5N HCl 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）强碱处理 0.5N NaOH 抽滤、洗涤、抽滤（pH8.0）PH7.4 0.01M PB液浸泡抽滤、浸泡 2、装柱、平衡固定层析柱装 柱：柱高度、无分层、无气泡 3、样本（人血清）准备抽静脉血分离血清透析（PH7.4 0.01M PB液 4度过夜） 4、研磨蔗糖备用（纯化IgG浓缩用）实验步骤5、上样、洗脱、收集洗脱液上样
4、 流速3ml/10min（记录上样总体积，保留部分血清）洗脱 流速30-40ml/cm2/h收集 5ml/管 （20%三氯醋酸滴定、分光光度法检测） 6、DEAE-纤维素再生2M NaCl 洗脱其他血清蛋白拆柱、 浸泡 PH7.4 0.01M PB液洗脱液抗原性鉴定双向琼脂扩散实验原理：可溶性Ag和Ab分别在琼脂凝胶内扩散。 相应的Ag和Ab相遇后，在比例合适时可形成白色沉淀线。7、洗脱液抗原性鉴定（双扩散法）实验步骤抗体抗原IgG回收率的测定分光光度法蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质 ，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值
5、与其 浓度成正比关系，故可作为 蛋白质定量测定的依据。实验实验 步骤骤9、合并含IgG的洗脱液，通过过蔗糖包埋法进进行浓缩浓缩 。 10、通过过分光光度法对浓缩对浓缩 后的IgG进进行回收率的测测定 。回收率=提取 IgG（mg） 12（mg/ml）上样血清体积OD280 1.43 回收体积 12（mg/ml）上样血清体积回收IgG纯度鉴定免疫电泳原理：（immune electrophoresis）先将抗原加到琼脂板的小孔内进行电泳，将样品中不同分子量和不同电荷的组分分离成若干 区带；然后分离的各抗原成分与电泳方向平行槽 中含相应抗体的免疫血清在琼脂中作双向免疫扩 散。各区带蛋白在相应位置与
6、抗体形成弧形沉淀 线。根据沉淀弧的位置、数量和形态，可分析样品中 所含抗原成分及其性质。实验实验 步骤骤人血清提纯物兔抗人血清双扩散电泳+-19酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgG20酶联免疫吸附试验原理利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深浅,可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的多少。检测方法有直接法、间接法、双抗体法和抗原竞争法。 21直接ELISA 间间接ELISA 双抗体夹夹心 法包被(未知抗原）加入酶标抗体洗板加底物加终止液包被(已知抗原）加入
7、待检标本 （未知抗体）加入酶标第二抗体 抗抗体洗板加底物加终止液包被(已知抗体）加入待检标本 （未知抗原）加入酶标抗体洗板加底物加终止液原理示意图图23人血清IgG抗体的检测直接ELISA法测定原理： 将待检标本包被反应板，再加入酶标羊抗人IgG抗体。当标本中存在IgG时，该抗体与包被IgG结合，最后形成IgG-酶标羊抗人IgG抗体复合物，加入底物产生显色反应。24包被：用包被缓缓冲液将纯纯化抗体稀释释至0、2、4、6、8、10mg/L 。在每个聚苯乙烯烯板的反应应孔中加0.1ml稀释释液，4过过夜。加酶标标抗体：每孔加入稀释释至工作浓浓度的酶 标标抗体100l，37孵育1h。洗涤涤：用洗涤涤液洗涤涤3次，每次3min，甩净净，拍干。洗涤涤：手工洗板，弃液拍干，重复5次加底物显显色：每孔加底物液50l，置37孵育15min。终终止反应应：每孔加入50l的2M H2SO4，混匀【步骤 】封闭闭：每孔加入封闭闭液0.1ml， 4孵育1h 。
