野生苍耳、栽培苍耳、组培苍耳提取物抑菌活性的比较研究

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1、http:/ 野生苍耳、栽培苍耳、组培苍耳提取物抑菌活性的比 较研究野生苍耳、栽培苍耳、组培苍耳提取物抑菌活性的比 较研究 杨继娟，杨媛，王琰，孟令剑，张雨政，雷国忠 甘肃农业大学草业学院，兰州（730070） E-mail： 摘摘 要：要：本论文利用生长速率法、黄瓜子叶法对野生苍耳、栽培苍耳、组培苍耳提取物的抑 菌活性进行了比较研究。结果表明，三种苍耳的丙酮提取物对 5 种供试菌EC50均值分别为 27.97mg/ml、28.22 mg/ml、28.89 mg/ml；在活体上 30mg/ml的供试浓度下，处理 32h后，三 种苍耳提取物对番茄灰霉病保护作用的防治效果分别为 36.24%、36

2、.87%和 38.03%，治疗作 用的防治效果分别为 31.73%、32.90%和 32.97%。对五种供试菌的抑菌活性和对番茄灰霉菌 保护作用及治疗作用的活体防效无显著差异。 关键词：关键词：苍耳；提取物；抑菌活性 植物源农药作为生物农药的一个组成部分，具有明显的优势，它取之于自然，用之于自然，低毒、低残留、对非靶标生物及环境安全，害物不易产生抗药性，在环境中易降解，可降低或避免化学农药带来的“农药公害”。 王问学等4测定了苍耳等植物的乙醇抽提物对卫茅尺蠖和菜青虫的药效， 结果表明幼虫在苍耳乙醇提取液处理的叶片上 56 小时内不取食；冯俊涛等5证实了苍耳丙酮提取物对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌

3、和苹果炭疽病菌的菌丝生长和苹果炭疽病菌孢子萌发的抑制作用较强，抑制效果均在 80%以上；李玉平等6研究苍耳的丙酮提取液对小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米大斑病菌的孢子萌发抑制率大于 93%。郭东艳7对苍耳提取物中的抑菌活性物质进行了分离、鉴定。何静8对苍耳提取物对有害生物的抑菌机理进行了研究。 从天然植物中提取活性物质并进行有效的利用目前还受到许多限制。野生植物资源有限、植物引种和驯化困难、可耕地面积日益减少等原因使得植物资源受限制；同一种植物不同品种、同一品种因产地及生态地理位置不同、同一种植物的不同部位其有效成份含量差别较大；同时在栽培过程中易受自然环境影响，使

4、产量和质量难以控制。植物组织培养技术的应用利用植物组织培养进行具有杀虫、杀菌活性成分的生产具有许多优越性。 因此，本试验对野生苍耳、栽培苍耳、组培苍耳的抑菌活性进行了比较研究，寻求苍耳组织培养技术在苍耳生产中的实用性，为苍耳植物源农药新的资源途径提供基础资料。 1 材料与方法材料与方法 1.1 供试材料供试材料 1.1.1 供试植物供试植物 野生苍耳采自兰州，栽培苍耳在农大校园内种植（种子采自兰州），将茎叶洗干净，置阴凉处晾干，粉碎过筛（40筛目，=0.37mm）后密封。置于04的冰箱中保存。组培苍耳为本试验中组织培养收集的材料。 1.1.2 供试菌种供试菌种 番茄灰霉病菌(Botrytis

5、cinerea Pers.)、辣椒丝核病菌(Rhizoctonia solani )、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium Schl.)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum Ell.et - 1 -http:/ Arthur）、番茄早疫病菌(Alternaric solani (Ellis et Martin)Jones et Grout)，采自甘肃兰州刘家堡乡的保护地蔬菜上，按常规方法分离、纯化后用 PDA 培养基在 04 冰箱中保存备用。 1.1.3 供试黄瓜子叶供试黄瓜子叶 供试黄瓜品种为“长春密刺”（甘肃省农科院科技开发公司），在50温水中恒

6、温催芽10min，在营养盘中培育子叶期黄瓜幼苗。 1.2 主要仪器及试剂主要仪器及试剂 仪器：标准筛（40 目 =0.37mm）、ZDX-35B 型座式自控电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、RXZ 智能人工气候箱（宁波江南仪器厂），DHG-9245A 型鼓风干燥箱（上海恒科技术有限公司）、SWCJ2FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），索式抽提器、RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）等。 试剂：葡萄糖（天津市光复精细化工研究所，分析纯）、琼脂 、吐温-80 溶剂：丙酮（分析纯） 1.3 方法方法 1.3.1 样品提取物的制备样品提取物的制备 将采集的植物组织洗净

7、后置阴凉处晾干，再放入恒温干燥箱（50）中烘干。用粉碎机充分粉碎后过筛（40 目，=0.37mm）制成干粉。收集组培苗，经蒸馏水冲洗，用滤纸吸干表面的水分， 再放入鼓风干燥箱 （50） 烘干至恒重后， 用研钵研碎后过筛 （40 目， =0.37mm）制成干粉。分别将各种样品 50g 装入滤纸筒中，以丙酮为溶剂采用连续回流提取法，在索式提取器中回流提取 36h，提取液用旋转蒸发仪浓缩至少量后转入刻度试管中，用丙酮定容为2g/ml(即 1ml 提取液相当于 2g 植物干样品），置于具塞刻度试管中密封，放入 04冰箱中保存备用。 1.3.2 离体生物活性测定离体生物活性测定 采用生长速率法10，测定

8、供试药液对供试菌种活性效果。在无菌条件下，将苍耳提取液按一定比例加入培养皿（=90mm）后，迅速倒入经灭菌后冷却至 45左右的PDA培养基， 摇匀， 制成处理液稀释浓度为 80mg/ml （即 1ml提取液相当于 80mg植物干样品， 下同） ，40 mg/ml、20 mg/ml、10 mg/ml和 5 mg/ml的平板，对照组加入等量的丙酮，每处理重复 3皿。待平板凝固后接入菌饼（将纯化好的供试菌种，在恒温（251）培养箱中黑暗培养5d，用=60mm的打孔器于菌落边缘 34mm处打取生长一致的菌饼），置于恒温（251）培养箱中黑暗培养，每隔 24h，用十字交叉法测一次菌落直径，直到对照长满培

9、养皿。计算菌丝生长抑制率，将各浓度的菌丝生长抑制率转换成机率值，浓度转换成对数值，用直线回归分析法计算出EC50 ，用下列公式计算菌丝生长抑制率： 菌落直径（mm）= 测量菌落直径的平均值6.0 抑制率（%）=对照菌落直径处理菌落直径对照菌落直径100 1.3.3 活体生物活性测定活体生物活性测定 参考李树正（1991）黄瓜子叶法12并有所修改，测定供试药液对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）的活性效果。待黄瓜子叶充分展开后摘取生长一致的子叶，将脱脂棉浸水后- 2 -http:/ 包裹叶柄，然后置于90mm培养皿中（培养皿底部垫有浸水海绵，上覆一层滤纸）。每处理一片子

10、叶，重复三次，以清水为对照。 保护作用：在苍耳提取液中加入一滴吐温-80 后分别用蒸馏水配成 80mg/ml、40 mg/ml、20 mg/ml、 10 mg/ml、 5mg/ml 的供试浓度， 采用浸渍法测定供试药液对番茄灰霉病菌 （Botrytis cinerea Pers.）的活性效果，具体方法为将子叶放入供试药液中浸 3min，取出等药液阴干后用打孔器（=6.0mm）在活化好的菌落边缘打取菌饼置于处理好的子叶中心，在恒温（251）光照（光照 12h，黑暗 12h）培养箱中培养，待对照充分发病后，每隔 4h 测量一次病斑直径。 治疗作用：子叶接种番茄灰霉病菌（Botrytis ciner

11、ea Pers.）后，在恒温（251）光照（光照12h，黑暗12h）培养箱中培养至初见病斑时，采用浸渍法进行处理，其它方法同保护作用。 防治效果按下列公式进行计算: 防治效果(%)=100 对照病斑直径处理病斑直径对照病斑直径2 结果与分析结果与分析 2.1 三种苍耳的提取物对五种供试菌菌丝生长的影响三种苍耳的提取物对五种供试菌菌丝生长的影响 野生苍耳、 栽培苍耳、 组培苍耳的丙酮提取物对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、辣椒丝核病菌(Rhizoctonia solani )、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium Schl.)、黄瓜黑星病菌（Clad

12、osporium cucumerinum Ell.et Arthur）和番茄早疫病菌(Alternaric solani (Ellis et Martin)Jones et Grout)5种不同的供试菌菌丝生长的抑制作用见表1、2和图1。 表1 3种苍耳的提取物对5种供试真菌菌丝生长的抑制作用 抑 制 率 Inhibition rate (%) 供试材料Experiment materials 浓 度Concentration （mg/ml） 番茄灰霉菌Botrytis cinerea 黄瓜枯萎菌Fusarium oxysporium黄瓜黑腥菌Cladosporium cucumerinum辣

13、椒丝核菌Rhizoctonia solani 番茄早疫菌Alternaric solani 5 27.50 25.3416.7030.68 17.39 10 32.64 43.75 21.82 38.98 22.39 20 51.48 51.93 31.25 53.98 32.61 40 67.28 71.90 50.34 70.85 46.84 野 生 苍 耳 80 79.71 83.83 64.56 82.20 59.11 5 26.70 24.2019.0931.82 22.39 10 32.39 44.66 25.00 38.07 28.41 20 53.75 52.05 36.02

14、51.14 35.45 40 68.30 74.02 49.40 72.80 47.29 栽 培 苍 耳 80 81.01 86.01 61.53 84.31 56.70 5 29.20 22.7319.3230.68 18.18 10 34.89 44.32 28.07 41.14 25.00 20 50.34 55.68 34.09 49.43 29.55 40 64.15 74.05 49.29 71.98 46.79 组 培 苍 耳 80 75.55 86.16 60.69 83.37 58.50 - 3 -http:/ 图图1 3种苍耳的提取物对5种供试真菌菌丝生长的抑制作用 3种苍

15、耳的提取物对5种供试真菌菌丝生长的抑制作用 Figure 1 Inhibition of the extract from three kinds of Xanthium sibiricum on the hyphae growth of five kinds of fungi0102030405060708090100野生苍耳 5.00 10.00 20.00 40.00 80.00 栽培苍耳 5.00 10.00 20.00 40.00 80.00 组培苍耳 5.00 10.00 20.00 40.00 80.00浓度（mg/mL）抑制率（%）番茄灰霉菌黄瓜枯萎菌黄瓜黑星菌辣椒丝核菌番茄早

16、疫菌表2 3种苍耳的提取物对5种供试真菌菌丝生长的毒力测定 供 试 药 剂Experiment chemicals 供 试 菌 种 Experiment fungus LD-P线 （y=） EC50（mg/ml） r 番茄灰霉菌 Botrytis cinerea y=1.2624x+3.4019 18.45 0.9915 黄瓜枯萎菌 Fusarium oxysporium y=1.3201x+3.4363 15.29 0.9927 黄瓜黑腥菌 Cladosporium cucumerinumy=1.2146x+3.0336 41.59 0.9910 辣椒丝核菌 Rhizoctonia solani y=1.2