共聚焦显微镜快速入门

《共聚焦显微镜快速入门》由会员分享，可在线阅读，更多相关《共聚焦显微镜快速入门（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、北京生命科学研究所北京生命科学研究所共聚焦显微镜快速入门共聚焦显微镜快速入门占 成Z北京生命科学研究所?共聚焦显微镜历史简介?共聚焦显微镜原理简介?LSM 510 META系统简介?LSM 510 META快速上手?影像中心的管理规定简介北京生命科学研究所共聚焦显微镜历史简介共聚焦显微镜历史简介北京生命科学研究所传统显微镜的缺憾传统显微镜的缺憾?在传统的荧光显微镜中， 来自汞灯或者氙灯的激 发光照射视野中的全部 样品，观察者可以用眼 睛直接观察，也可以用 CCD等设备直接拍摄荧光 图像。?传统显微镜得到的图片 容易受到轴向干扰和侧 向干扰的影响而显得有 些模糊。北京生命科学研究所焦点模糊焦点模

2、糊?对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于 在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激发，焦平 面上的荧光图像将有一定的模糊，这被称为轴向（Z） 干扰；?另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平面上 邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的对比度降 低，这被称为侧向（XY）干扰。北京生命科学研究所共聚焦显微镜优势共聚焦显微镜优势?共聚焦显微镜很好的解 决了传统荧光显微镜中 焦面模糊的问题，解决 了图像的轴向和侧向的 干扰。?共聚焦显微镜同时还提 供了光切能力，能对厚 样品（例如花粉颗粒， 果蝇大脑等）进行三维 层切成像。北京生命科学研究所共聚焦显微镜发展历史共聚焦显微镜发展历史?1955

3、年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦 显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。?1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。?1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。?1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可 以消除焦点模糊，得到清晰的图像。?1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显 微镜。北京生命科学研究所?由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激光， 成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为 “laser scanning confocal microscope”,“激 光扫描共聚焦显微镜”。?激光共聚焦扫描显微镜发展至今

4、，已经不再是 普通的光学显微镜，而是光学显微镜与激光， 高灵敏度探测器，高性能计算机和数字图像处 理软件相结合的新型高精度显微成像系统。北京生命科学研究所共聚焦显微镜原理简介共聚焦显微镜原理简介北京生命科学研究所共聚焦与传统显微镜的原理差别共聚焦与传统显微镜的原理差别?照明方式不同：传统显 微镜是一次性照明整个 视野中的样品，因此可 以用眼睛直接观察或者 用CCD获取图像，没有时 间延迟；而共聚焦显微 镜是逐点成像，无法用 眼睛成像，也无法用CCD 获取图像，只能用探测 器收集每个象素点的信 号，再通过软件重构图 象，有一定的时间延迟。北京生命科学研究所Pinhole的作用Pinhole的作用

5、?共聚焦显微镜在探测器 前放置一个pinhole小孔， 用来阻止非焦面的信号， 同时通过焦面的信号， 以消除焦点模糊。正是 因为pinhole小孔的存在， 共聚焦显微镜具有了光 切能力，能对厚样品进 行三维层切成像。北京生命科学研究所共聚焦的局限共聚焦的局限?虽然共聚焦显微镜能获取比普通显微镜更清晰的图片， 但实际上共焦焦显微镜的分辨率只比普通光学显微镜 有少量的提高，普通光学显微镜的分辨率理论极限大 约是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是 0.15微米。?共聚焦显微镜的一大限制是成像速度较慢，这限制了 其用来研究生物领域中的一些快事件。北京生命科学研究所LSM 510 META系

6、统简介LSM 510 META系统简介北京生命科学研究所系统组成系统组成?倒置荧光显微镜?激光器?扫描头?系统控制塔?电脑及显示器北京生命科学研究所倒置荧光显微镜倒置荧光显微镜 Axiovert 200M?Plan-NeoFluar 2.5?Plan-NeoFluar 5X?Plan-NeoFluar 10X?Plan-NeoFluar 20X?Plan-NeoFluar 20X corr ph2?Plan-NeoFluar 40X?Plan-NeoFluar 40Xcorr Ph2?Plan-Apochromat 63X/OIL北京生命科学研究所激光器激光器?405nm激光器?Ar离子激光器

7、（458nm， 488nm，514nm）?HE-NE绿激光（543nm）?HE-NE红激光（633nm）北京生命科学研究所扫描头扫描头?2个荧光探测器?一个META探测器?一个透射探测器北京生命科学研究所系统控制塔系统控制塔扫描头控制 激光控制 数据通信北京生命科学研究所系统功能简介系统功能简介?用作高精度荧光显微 镜?获取三维图像?获取多荧光标记图像北京生命科学研究所?时间序列扫描成像，可对样品进行长时间的动 态观察，获取样品不同时间的图像。?FRET实验北京生命科学研究所?光谱扫描功能，既可 拆分有光谱重叠的不 同染料，也可以获取 未知染料的发射光谱 曲线。北京生命科学研究所串色串色?串色

8、是指两种或多种 荧光染料的发射光谱 互相重迭的现象：当 使用多种荧光染料标 记标本时，或当标本 具有很强的自发荧光 时，很容易产生串色 现象。北京生命科学研究所串色的分类串色的分类?一类是：两个荧光染料的激发光谱没有重迭，但发射 光谱有重叠。这类荧光串色可以使用序列扫描 （multi-track）的方法来排除：即先使用第一种荧光 染料的激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染料 的激发光扫描第二张图像。?另一类是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光谱都有 重迭。这类荧光串色只能使用光谱扫描（lambda scan） 的方法来排除。?本系统同时具备消除上述两种串色的功能。北京生命科学研究所LSM 51

9、0 META快速上手LSM 510 META快速上手北京生命科学研究所实验前实验前?欢迎使用LSM 510 META，在您来之前 最好能将样品在其他普通的荧光显微镜 上看过，确认之后再拿来。北京生命科学研究所开机流程开机流程（仅对有独立操作资格者）（仅对有独立操作资格者）?开启电闸，此闸一般已经开启。?开启系统总开关，“on”，你将会听到显 微镜自检的响声。?开启显示器，电脑。?预热10分钟。北京生命科学研究所?开启软件，进入 “START EXPERT MODE”，系统进行自检， 你将会再次听到显微镜 自检的响声。?打开汞灯开关。北京生命科学研究所?点击“laser”图标，开启 所需要的激光

10、。?开启AR离子激光时，先 点击“standby”，再点击 “on”，最后将激光的电 流设置在25（有利于 激光器寿命）。其他激 光器，直接点击“on”即 可开启。激光开启完毕 后，关掉该窗口。北京生命科学研究所?点击“config”，设置 系统成像光路，不熟 悉如何设置，请由管 理员代劳。?点击“scan”，设置扫 描参数，控制探测器 的负高压，pinhole 的大小，扫描速度， zoom大小，激光强 度等参数。北京生命科学研究所scan control窗口命令详解scan control窗口命令详解?点击“MODE”，出现扫 描象素精度，扫描速 度，数据存储位数， 平均次数，ZOOM大小

11、等参数设置。北京生命科学研究所Mode设置Mode设置?Frame size：控制扫描象素精度，指一幅图像由多少 个象素点构成，由于受到共聚焦本身分辨率的限制， 因此没有必要选择太大，一般低倍镜使用512X512即 可，高倍镜选1024X1024即可。此项也可在下面的框 中直接输入数据。?line step指的是每隔多少条扫描线，开始采集数据， 选择1即可。?scan speed：控制成像速度，速度越慢，信号越强， 对样品的漂白也越大，反之亦然。一般选择速度为7比 较合适。北京生命科学研究所?data depth:图像的灰度等级。?scan direction：控制扫描方式，一般选择前者。?m

12、ode，method,number:一般用来确定平均的次数， 平均次数越多，图像的信噪比越好。为了提高图像的 质量，常用的方法为：提高scan speed，同时提高平 均的number，这样对样品的漂白也较小。?ZOOM：图像的放大，增大ZOOM，能有助于看清图 像的细节，但是ZOOM的增大是有限定的，这取决于 共聚焦显微镜的分辨率，或者说取决于物镜的倍率。 例如在10X物镜下，当ZOOM超过10时，就没有多少 意义了。北京生命科学研究所?点击“channel”，出 现pinhole大小， detector gain， amplifier offsect， amplifier gain以及 激

13、光强度等参数的设 置。北京生命科学研究所Channel设置Channel设置?pinhole：pinhole越大，信号越强，来自非焦面的干扰 也越强，系统的Z方向分辨率降低。一般选择为1 ?Airy unit时，能在信号强度和Z方向分辨率之间得到 一个较好的平衡?detector gain：指探测器的负高压值，一般选取在 650附近为佳，如果太低，则信号较弱，可能需要提 高?激光强度，这加大对样品的漂白，如果太高，则噪声 也较高，且容易损害探测器。不宜长时间超过800， 也不宜低于500北京生命科学研究所?amplifier offsect：用于扣除背景噪声用，在扣除背 景的同时也可能会对信号

14、有影响，因此不宜过低。?amplifier gain：信号的电子放大，一般选择为1即可， 不宜超过2。?激光强度的控制：可根据样品信号的强弱，以及 detector gain的大小，以及样品是否容易漂白等综合 因素来考虑。不同激光的强度是不一样的，一般来说5 的488nm激光大约等于100的543nm激光。北京生命科学研究所?如果需要获取三维图像， 点击“Z stack”。北京生命科学研究所Z stack设置Z stack设置?Mark first/last：确定三维扫描时的最初位置和最终 位置。?选择最初位置和最终位置的时候，需要点击“Fast XY”， 一边扫描一边调节物镜的焦面，反向旋转

15、微调钮到最 初位置，点击“Mark first”，再正向旋转微调钮到最 终位置，点击“Mark last”。?完成上述步骤之后，点击“Z slice”，然后点击 “optimal interval”以确定每隔多少厚度成一幅像。?设置好“mode”和“channel”中的参数后，点击“start”开 始获取三维图像。?该窗口中的其他设置保持原始设置不变。北京生命科学研究所实验中实验中?实验过程中，经常需 要先用显微镜找到样 品，再用共聚焦来扫 描图像，点击“眼睛” 为显微镜观察模式， 点击“LSM”为扫描图 像模式。北京生命科学研究所?显微镜的操作可以用 软件实现，点击“显 微镜”图标可以看到

16、物镜，滤片，荧光， 透射光的操作按钮。 也可以直接操作显微 镜。北京生命科学研究所汞灯快门卤素灯开关手动调焦滤光片选择物镜选择样品台调节请勿动北京生命科学研究所调焦调焦?放样品时注意玻片不要碰到物镜表面，以免损坏镜头。?在找焦距的时候，应先用低倍镜（5X或10X）粗调，再 细调。操作中不应太快，太急，以免物镜顶住样片， 损坏镜头（特别是在使用高倍物镜时，更应小心！）。?调焦过程中，当听到报警声时，说明已经调到最低点， 请立刻停止，并反向调节。?实验时，请将样品表面的液体擦干，避免滴到镜头上， 污染镜头。使用油镜时，滴油不宜过多，使用完毕后， 要及时清洗镜头。北京生命科学研究所扫描图像扫描图像?在扫描图像之前，请务必关掉汞灯的 “shutter”，并点击“LSM”图标，然后开 始扫描，这样有利于仪器的寿命。?在“scan”和“mode”窗口中设置好初步的 扫描参数。北京生命科学研