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1、核酸提取及常见问题分析第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。前言前言第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第一部分：DNA提取方法简介DNADNA提取的几种方法提取的几种方法q 基因组DNA的提取 CTAB法
2、SDS法 其它DNADNA提取的几种方法提取的几种方法q 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法q CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析
3、出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。q CTAB提取缓冲液的经典配方组组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0 ）NaCl CTAB-巯巯基乙醇终浓终浓 度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V )0.1%（V/V ）使用前加 入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因
4、组DNADNA CTABCTAB法法q CTAB提取缓冲液的改进配方组组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0 ）NaCl CTAB PVP40-巯巯基乙醇终浓终浓 度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V )5%(W/V )2%（V/V） 使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法q CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组基因组DNADNA CTABC
5、TAB法法q SDS法原理基因组基因组DNADNASDSSDS法法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。组组份Tris-HCl （pH8.0 ）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS终浓终浓 度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法DNA提取缓冲液q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA
6、溶液基因组基因组DNADNASDSSDS法法基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融 法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法q 根据细胞裂解方式的不同有：基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 吸附材料结合法：q 根据核酸分离纯化方式的不同有： 硅质材料 阴离子交换树脂 磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。基因组基因组DNADNA其它方法其它方法 浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法：利用R
7、NP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法q 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法q 碱裂解法流程图对数期菌体
8、溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法q 煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNADNA差速离心法差速离心法q 差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质
9、置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸
10、分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长 ，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较 少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（ 老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则 菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为 低拷贝或大质粒，则应加大菌 体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失 ）细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解 ，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适
11、当的裂 解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌 体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟） ，否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会 有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先 用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作 要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应
12、的 去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化q 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理q 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可 以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入 200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化q 多酚的去除： 在抽提液中加入防
13、止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合核酸分离、纯化核酸分离、纯化q 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉 淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于 充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生
14、酸解 基因组DNA的提取质粒DNA的提取1.DNA中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制 后续酶解反应3.DNA中残留有金属离 子1.重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发3.增加70乙醇洗涤的 次数（2-3次）DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原 因对 策1.材料不新鲜或反复冻 融2.未很好抑制内源核酸 酶的活性3.提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融2.液氮研磨或匀
15、浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题二：DNA降解。对 策原 因1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料2.动植物要匀浆研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀
16、6.洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题三：DNA提取量少。对 策原 因第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介RNARNA提取的通用方法提取的通用方法q 异硫氰酸胍/苯酚法 原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 RNARNA提取的通用方法提取的通
