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1、D O I:1 0. 3 7 2 4/S P. J . 1 0 9 6. 2 0 1 1. 1 0 5 2 6纳米纤维固相萃取柱萃取-高效液相荧光法分析头发皮质醇陈利琴1 康学军* 1,2 晏 嫣1 顾忠泽2 陆祖宏11( 东南大学儿童发展与学习科学教育部重点实验室,南京 210096)2( 东南大学苏州研究院苏州市环境与生物安全重点实验室,苏州 215123)摘 要 采用基于纳米纤维固相萃取的高效液相色谱-荧光测定 (HPLC-Flu) 法测定头发中的皮质醇水平。以新型纳米纤维萃取柱( PFSPE) 提取头发样本浸出液, 用 100 mL 乙醇洗脱, 再加入 230 mL 浓 H2SO4反应
2、2 min,反应物加水混合后用 PFSPE 柱提取, 最后用 50 mL 甲醇直接洗脱后注入色谱体系 20 mL 进行分析。此方法的检出限为 0.5 pg/mg(S/N=3) , 日内精密度和日间精密度分别低于 6.8% 和 8.9% , 平均方法回收率为 88.9% 。本方法提取过程简便、 快速、 环保, 而且可以准确测定头发样本中的皮质醇水平, 为生理学、 精神医学、 体育医学、 认知科学、 心理学等众多研究提供一种可行的测定方法。关键词 纳米纤维; 头发;皮质醇; 皮质酮; 高效液相色谱;荧光检测2011-05-24 收稿; 2011-08-04 接受 本文系国家“ 九七三” 基金项 目
3、 (No. 2007CB936300), 江 苏省工业支撑项 目 资 助 ( No. SBE201000676) , 苏 州 市 科 技 计 划 资 助 ( Nos. SYJG0912, SYN201006, SG201028) 和东南大学优秀博士论文基金资助 *E-mail: 1 引 言在精神生物学研究中, 皮质醇( 啮齿类动物是皮质酮) 是一种非常重要的激素, 它被称为“ 压力荷尔蒙” , 人体面临生理、 心理刺激时, 其分泌量增高( 应激反应)1。目前研究中采用的血液、 唾液、 尿液等样本测试皮质醇的水平, 只能反映应激及时变化或一定时间( 尿液/一天) 的累积情况。而对于研究对象一段时
4、间( 数月以上) 的应激情况进行了解, 就可以采用头发这种生物样本。研究证实, 头发能够反映人体长期的摄药信息( 可以追溯到几个月之前) , 头发皮质醇是一种很好的研究长期下丘脑-垂体-肾上腺轴( HPA 轴) 活性的工具, 可以客观测量慢性应激2。Pereg 等3指出, 在诸多心梗发病征兆中, 头发的皮质醇水平是判断发病风险最明显的生物学标志物。采用头发基质, 对于分析测试具有很多优势, 如头发生长规律, 为研究者提供一种追溯性研究窗口; 头发采样无创、 简便、 无需专业指导; 头发样本可以室温储存等2。头发皮质醇分析将成为生理学、 精神医学、 体育医学、 认知科学、 心理学等众多学科的重要
5、研究手段。目前, 头发中皮质醇测定多采用放射免疫法4、 酶联免疫法5及 LC-MS 法6。免疫法灵敏度较高, 能够检测出头发中的痕量皮质醇, 但存在交叉反应、 测定结果偏高。各种商业性的免疫试剂盒测定的结果差异性较高, 试剂盒的成本也较昂贵。LC-MS 法虽然准确灵敏, 但需要昂贵的仪器,故一般实验室难以普及。此外, 还有 HPLC-Flu 法测定头发中皮质醇分布的报道7, 采用传统 SPE 和溶剂萃取的方法分别提取头发浸出液和硫酸衍生产物。本研究优化改进了头发样本前处理操作, 用本研究组建立的基于电纺纳米纤维的固相萃取技术( Packed-fiber solid-phase extracti
6、on, PFSPE)8,9取代文献方法 SPE 和溶剂萃取步骤, 省略了挥发提取溶剂浓缩目标物的操作, 使热不稳定的目标物提取效率大大提高, 同时使前处理操作时间大大缩短、 操作更为简便, 实现了头发中皮质醇的高效灵敏检测。2 实验部分2. 1 仪器与试剂 LC-20AD 高效液相色谱仪、 RF-10AXL 荧光检测器、 SIL-20AC 自动进样器、 CTO-20A 柱温箱均购自日本岛津公司; DDS-PH 计( 上海理达仪器厂) 、 离心机( 无锡瑞江公司) ; XW-80A 漩涡混合器( 上海青浦沪西仪器厂) ;AL104-IC 分析天平( METTLER TOLEDO) ;冷冻混合型球
7、磨仪( MM 400, 德国莱驰公第 40 卷2012 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry第期请提供第一作者的手机号码以方便编辑部和作者联系,此号码不会公布在期刊中;请认真核实参考文献 的 作者,期刊,年,卷,期,起止页码是否正确以及文献 是否与文中一一对应。第一作者手机号码： 15510 8 2 548 2 ， Em a i l ： l i q i n c h e n 8 0 y a h o o . c o m . c n司) ; 调速多用振荡器 HY-2( 常州国华电器有限公司) ; XWy-01
8、 型纳米纤维固相萃取柱( 苏州先伟纳米技术有限公司) 。皮质醇( 又名氢化可的松) 和皮质酮标准品购自中国药品生物制品检定所, 色谱纯甲醇购自山东禹王化学品公司, 其他试剂硫酸、 乙醇、 ( 分析纯) , 水为重蒸去离子水。2. 2 色谱条件 岛津 VP-ODS C18色谱柱(150 mm4.6 mm, 5 mm); 荧光检测波长: 激发波长 360 nm, 发射波长480 nm; 流动相: 甲醇: 0.05 g/L 醋酸铵 7030 (V/V, pH 5.0, 磷酸调节) 。流速: 1.0 mL/min, 进样量: 50 mL。2. 3 溶液配制 标准溶液: 精密称取皮质醇标准品适量, 加甲
9、醇溶液配制成 0.1 g/L 的标准储备液。工作溶液需每天临用前用甲醇稀释至相应的浓度, 在-4保存。内标溶液: 精密称取皮质酮标准品适量, 加甲醇溶液制成 0.1 g/L 的储备液, 内标工作溶液为 200 mg/L( 用甲醇稀释) 。磷酸盐缓冲液: 取 KH2PO4( 9.07 g/L) 溶液 19.4 mL 和 Na2HPO4( 11.87 g/L) 溶液 30.6 mL, 混匀, 用0.2 mol/L 的 NaOH 调节 pH 为 7.6。2. 4 样品前处理2. 4. 1 头发样处理 将约 200 mg 的头发样放入 200 mL 烧杯中, 加入 5 mL 甲醇, 超声清洗 2 mi
10、n( 两 次) , 用去离子水冲洗干净, 置于电热恒温干燥箱内, 37干燥 8 h。干燥后的头发剪碎, 放入 25 mL 不锈钢研磨罐内。将研磨罐装入冷冻混合型球磨仪, 研磨 4 min( 频率 30 Hz) 。准确称取 100 mg 发样粉末,加入 3 mL 磷酸盐缓冲液, 加入 10 mL 内标溶液, 混匀。振荡 16 h, 12000 r/min 离心 5 min 后, 取上清液 2.图 1 新型纳米纤维萃取柱及阵列萃取装置Fig.1 Novel packed-nanofibers solid-phase extractioncolumn and array extraction dev
11、ice5 mL 留待萃取。2. 4. 2 萃取柱活化 将新型纳米纤维萃取柱(图 1 所示)分别用 100 mL 的甲醇、 水上样萃取柱, 用适配注射器吸取空气压入萃取柱, 使溶液缓慢 逐滴被压出。2. 4. 3 固相萃取步骤一 取备用的浸出液上清适 量上样活化好的萃取柱, 同法操作使溶液通过萃取柱, 上清液全部过柱后, 用 100 mL 乙醇洗脱, 洗脱液留待衍生反应。此萃取过程可以采用图 1 所示的阵列固相萃取装置同时操作 6 个样品。2. 4. 4 衍生反应 加入 230 mL 浓 H2SO4到洗脱液 中, 于 70反应 2 min, 反应结束后加水至 2 mL, 放入冰箱冷却 10 mi
12、n。2. 4. 5 固相萃取步骤二 将衍生溶液全部上样通过活化后的萃取柱, 最后用 50 mL 甲醇洗脱至自动进 样小瓶中, 混匀, 进样检测。3 结果与讨论3. 1 色谱条件选择 由于本研究组在前期唾液皮质醇检测的研究中已成功摸索出一套适合皮质醇检测的色谱条件10,经实验证实, 此色谱条件可稍作调整就能适用于头发中皮质醇检测, 所以本文调整了流动相中有机相与水相比例, 使出峰时间控制在 15 min 之内。由图 2 可见, 在此条件下, 头发以及大鼠毛发中内源性物质不干扰皮质醇和皮质酮的测定, 1 号峰为皮质醇衍生产物, 2 号峰为皮质酮衍生产物。3. 2 浸出液选择 从头发中提取皮质醇的浸
13、出液主要有甲醇、 磷酸盐缓冲液、 低浓度的盐酸和 NaOH 溶液。选择同一种发样, 用本方法测定, 对 4 种浸出液都进行了发样中皮质醇浸出效率考察。其中选择甲醇作为浸出液分 析 化 学第 40 卷图 2 头发与大鼠毛发中皮质醇与皮质酮的 HPLC 图Fig.2 Chromatograms of cortisol and corticosterone in human hair and rat hairA. 水加标衍生图谱 ( 皮质醇和皮质酮各加 6.7 mg/L) (Derivatization chromatogram of spiked water with 6.7 mg/L of co
14、rtisol and corticosterone); B. 头发加标衍生图谱( 皮质醇和皮质酮各加 6.7 mg/L) (Derivatization chromat-ogram of spiked hair with 6.7 mg/L of cortisol and corticosterone); C. 实际头发样本加内标衍生图谱(Derivatiza-tion chromatogram of actual hair with 6.7 mg/L of corticosterone); D. 实际头发样本未加内标衍生图谱(Derivat-ization chromatogram of ac
15、tual hair without internal standard); E. 大鼠毛发衍生图谱(Derivatization chromatogramof rat hair ); F. 大鼠毛发加标衍生图谱( 加皮质酮 6.7 mg/L) (Derivatization chromatogram of spiked rat hair with6.7 mg/L of corticosterone); 1. 皮质醇衍生峰(Derivative of cortisol); 2. 皮质酮衍生峰(Derivative of corticoster-one)。时, PFSPE 柱提取前需要将甲醇液挥干
16、, 再用去离子水复溶后过柱提取。对比实验结果( 表 1) , 发现磷酸盐缓冲液的效果最佳, 甲醇次之, 氢氧化钠最差。碱性条件下浸出溶液会很快变成深褐色, 在酸、 碱性介质中甾体类化合物结构不稳定, 这可能是导致浸出效率低的原因。文献6中, 皮质醇回收率较低, 也支持这个推测。而甲醇作为浸出液需表 1 浸出液结果比较 Table 1 Comparison of incubation solution浸出液 Incubation solution 皮质醇峰面积(n=5) peak area ofcortisol磷酸盐缓冲液 Soerensen buffer358577.6%甲醇 Methanol263888.7%0.1 mol/ L 盐酸 HCL871810.3%0.1 mol/ L 氢氧化钠 NaOH-要溶剂挥干, 复溶等操作, 多步骤的操作环节可能导致结果次于磷酸盐缓冲液。从提取效率和操作简便性等因素综合考虑, 本实验最终选择磷酸盐缓冲液作为头发中皮质醇的浸出液。3. 3 提
