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1、1人牙周膜细胞在双氧水处理后纯钛表面的活性作者：侯豫，王永，张丽，吴承龙【关键词】 牙周膜； 细胞培养； 钛； 碱性磷酸酶； 人牙周膜细胞； 双氧水Abstract Objective: To investigate the application possibility of hydrogen peroxide pre-treated titanium in oral clinic. Methods: The proliferation and alkaline phosphatase （ALP ） activity of human periodontal ligament （hPDL ）
2、 cells attached on titanium with four kinds of surface （smooth, rough, etched, hydrogen peroxide treated）were detected. The growth of primary and passaging cells was observed with invert microscope, and the morphology of cells was observed with scanning electronic microscope （SEM）; ALP activity was
3、tested with enzyme-linked immunosorbant assay. The morphology, immunohistochemistry features, proliferation and ALP acyivity of cells on the four kinds of titanium were compared. Results: The hPDL cells could grow and proliferate on four kinds of titanium. The cell proliferation on titanium treated
4、by hydrogen peroxide was 2better than those in the other three groups（P0.05）. Conclusion: Titanium treated by hydrogen peroxide is more beneficial to attachment and proliferation of the cells than titanium processed by the other three ways. Cells in the four groups all showed ALP activity, and among
5、 them, the activity in cells of hydrogen peroxide treated group is the highest（P0.05）.Key words periodontal ligament; cells culture; titantium; alkaline phosphatase; human periodontal ligament cells; hydrogen peroxide种植体以其有效的支持、良好的咀嚼功能、方便的清洁和护理被广泛应用于口腔临床治疗中。理想的种植体要求种植体-软组织界面有类似天然牙上皮附着的结构，形成紧密的上皮“袖口”
6、 ，成为一种功能性生物屏障。它有保护种植体在复杂的口腔环境中免受细菌及其他致炎因子侵入而保持长期稳定的作用。近代牙周病学已证明：牙周组织再生的细胞学基础是牙周膜细胞，而牙周膜细胞是牙周膜中最多、功能上也是最重要的细胞1 。它是种植体-软组织界面中的重要组成部分，研究发现其具有一定的异质性既有成纤维细胞的特性，又有成骨细胞的特性，如：具有较高的碱性磷酸酶（ALP ）活性、能合成和分泌大量的胶原和非胶原蛋白等2 。钛3金属以其良好的生物活性被作为首选的种植体材料并广泛应用于临床，但其初期的稳定性及长期的成功率仍不能让人满意3 。为此，采用体外培养人牙周膜细胞（hPDL）的方法对其在经过 4 种不同
7、处理的钛片上的生长、增殖及活性进行检测。1 材料与方法1.1 实验器械钛片（宝鸡科迪普有色金属加工有限公司） ，扫描电镜（S-3400N,日本日立公司） ，倒置显微镜（XD-101 型，南京江南电股份有限公司；超净工作台（苏州净化设备公司） ，离心机（TDL-40型，上海安亭科学仪器厂） ；酶标光度仪（Bio-Tek E1312E,USA） ，细胞计数板（浙江省玉环县求精医用仪器厂） 。1.2 实验材料-MEM 培养基（海克隆生物化学制品有限公司） ，胎牛血请（杭州四季青公司） ，胰蛋白酶、型胶原酶（美国 Sigma 公司） ，二甲基亚砜（DMSO，捷瑞生物工程有限公司） ，MTT 试剂盒（凯
8、基生物科技发展有限公司，KeyGen） ，ALP 检测试剂盒（南京建成公司） ，波形丝蛋白抗体、角蛋白抗体、免疫组织化学试剂盒（武汉4博士得公司） 。1.3 实验步骤1.3.1 钛片的处理光滑组与粗化组钛片由西安宝鸡科迪普有色金属加工有限公司制备提供。具体方法如下：用直径 10 mm 纯钛棒线切割加工成厚 1 mm 的圆钛片，以金相砂逐级打磨至 1 200 目，直至表面平滑、呈现灰白的金属色为止，然后用丙酮、75乙醇和去离子水在超声清洗器（KQ250 ）轮流清洗 15 min,以除去材料表面机械加工而残留的油污，40 烤箱烘干，即得到光滑组钛片。再以 40 目金刚砂喷光滑钛片的表面，每试样 3
9、0 片样本表面呈均一灰色 ，进行上述同样的超声清洗后，40 烤箱烘干，得到粗化组钛片。钛片的分组：钛片经以上处理后分为 4 组：光滑组、粗化组、酸蚀组（同粗化组处理后用 5.8 mol/L HCl 和 8.96 mol/L H2SO4 混合液处理10 min，双蒸水冲洗，50干燥）及双氧水组（同酸蚀组处理后，8.8 mol/LH2O280 处理 30 min,400 热处理 1 h） 。1.3.2 人牙周膜细胞 Human Periodontal Cells hPDL的原代培养及传代5（1）组织来源：正畸需拔除的 1117 岁青少年的双尖牙（A、 B、C、D 四区均可） ，无炎症、无龋坏的正常
10、牙齿（贵阳医学院附院颌面外科提供） ；（2）细胞培养：取 1117 岁青少年正畸需拔除的双尖牙用生理盐水冲洗 3 遍，放入加有 10 双抗的DMEM 培养基中立即带回实验室，在超净工作台上用加入 10双抗和 10甲硝唑的 D-Hanks 液冲洗 3 遍。然后将牙齿放入含0.1型胶原酶（2 ml）的青霉素小瓶中，在 37 孵育箱中消化1 h 并且每 10 min 震荡 1 次。终止消化后用吸管吹打牙齿根面，离心 8 min（ 1 000 r/min） ，加入含 10血清和 1双抗的高糖的 a-MEM 培养基，移入培养瓶中并将培养瓶放入 37 CO2 孵育箱中培养，镜下见细胞贴壁后隔日换液；（3）
11、 hPDL 的传代：待细胞长至瓶底 80后，用 25%的胰蛋白酶以 12 消化传代。1.3.3 hPDL 的鉴定取生长良好的第 4 代细胞做细胞爬片，1 周后采用 ABC 法进行波形丝蛋白和角蛋白染色鉴定人牙周膜细胞。正常的 hPDL 来源于中胚层，抗波形丝蛋白阳性，而抗角蛋白染色阴性。1.3.4 hPDL 的 HE 染色取生长良好的第 4 代细胞做细胞爬片，1 周后将爬片取出，6丙酮固定后常规 HE 染色，光镜下观察并拍照。1.3.5 hPDL 的接种将处理好的钛片置于 12 孔培养板内，取生长良好的第 4 代牙周膜细胞，0.25的胰蛋白酶消化后调整细胞浓度至 10104/ml,取0.1 m
12、l 该细胞悬液涂布于钛片表面，6 h 后每孔加入 1 ml H-DMEM 培养基，放入 37 CO2 孵育箱中继续培养。1.3.6 MTT 法检测材料的细胞毒性取生长良好的第 4 代细胞，将其按 1104 个接种到 24 孔板中，每孔培养液 0.2 ml，分为 4 组，每组 20 个复孔，细胞贴壁后第 2 天每孔加入 MTT 溶液 0.5 ml，离心后在 37 CO2 孵育箱中继续培养 4 h 后弃去上清培养液，每孔加入 1 ml 二甲基亚砜（DMSO） ，在摇床上震荡 15 min，使结晶物充分溶解。选择波长550 nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，每组 20 个样本求均值。1.3.
13、7 钛片表面 hPDL 数的测定分别于接种后每天取出钛片各 20 块 D-Hanks 冲洗 3 遍，置7入另一块洁净的 24 孔培养板内，胰蛋白酶消化 2 min，吸出胰蛋白酶，加入含血清的 DMEM，每孔 0.5 ml。用吸管吹打钛片表面，用血球记数板计数，将计算结果换算为每毫升悬液所含细胞数，每组重复计数 4 次。每天计数 1 次，共计数 8 d。1.3.8 hPDL 的 ALP 活性检测取生长良好的第 4 代细胞接种（分为 4 组，每组 20 块钛片） ，每孔加入矿化液（110-2mol/L B 甘油磷酸钠、50 mg/L 维生素C、110-7mol/L 地塞米松）培养 2 d，每孔加入
14、 0.1 ml 0.1tritonX-100,4 过夜。加入底物 37 培养 30 min，用 0.1 NaOH 终止反应。酶标仪测 OD 值，波长 520 nm。每组 20 个样本求均值。测 6 d，以矿化时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制人牙周膜成纤维细胞的 ALP 活性图。1.3.9 扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察 4 种钛片表面形态取已经处理完毕的钛片各 1 片（共 4 片）置于扫描电子显微镜下观察其表面形态。实验条件：加速电压 30 kV，电流 510-10，工作距离 15mm。81.3.10 扫描电子显微镜（Scanning el
15、ectron microscope,SEM）观察人牙周膜细胞在 4 种钛片上的生长形态将生长良好的第 4 代细胞接种在钛片上培养 3 d，PBS 冲洗3 遍，戊二醛固定 30 min，自然干燥后喷金，扫描电镜下观察细胞形态并拍照。实验条件：加速电压 30 kV，电流 510-10，工作距离 15 mm。1.4 统计分析实验结果选用 SPSS11.0 统计软件包，数据用均值标准差（xs）表示，采用方差分析， P0.05 时差别有统计学意义。2 结果2.1 人牙周膜细胞的形态细胞呈梭形、多角形或星形，胞突细长，胞浆丰满，细胞核 12 个，呈圆形或椭圆形。细胞密度较低时交织成网状，细胞密度较高时排列
16、成束状或旋涡状。见图 1 和图 2。2.2 人牙周膜细胞的鉴定免疫组织化学实验显示细胞波形丝蛋白染色阳性，胞浆为棕黄色；角蛋白染色阴性，苏木精复染后胞核呈紫色证明为中胚层组织来源。92.3 扫描电镜下钛片的表面形态扫描电镜照片清楚的显示了四组钛片样本的表面形态差异（见图 58） 。光滑组钛片表面在电镜下显示出由于砂纸打磨造成的规则的环状打磨线条，但是表面基本光滑，无明显的凸起和凹陷；粗化钛片表面非常粗糙，有非常不规则的不同形态的凹陷和尖锐的凸起；酸处理钛片表面微孔较粗化组小且均匀；双氧水处理钛片表面出现多级孔洞的结构，并且表面的凸起和凹陷也较粗化钛片及酸处理钛片更为柔和，还可以看到表面有一些比较均匀的结节状沉积层，钛表面被完全覆盖。2.4 细胞接种在 4 组钛片上的扫描电镜观察细胞在 4 组钛片上都能生长而且形态相似，都呈不规则的梭形。见图 912。2.5 MTT 法检测材料的细胞毒
