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1、广州医学院硕士学位论文Y8 9 8 5 7 7炎症因子I L 一8 和抗炎症因子I L 1 3 在原发性肾病综合征患儿血、尿中的检测及其临床意义 研究生：指导老师：专业：单位：陈英高岩教授儿肾内科广州市儿童医院广州医学院广卅I2 0 0 6 年5 月爨症因子I L 8 和抗炎症因子I L 1 3 在原发性肾病综台征患儿血、尿中的检测及其临床意义炎症因子I L 一8 和抗炎症因子I L 一1 3 在原发性肾病目的：综合征患儿血、尿中的检测及其临床意义研究生：指导老师：专业：陈英高岩教授儿肾内科中文摘要探讨I L 一8 、I L 1 3 与原发性肾病综合征( P N s ) 发病机制的关系。方法：
2、以2 0 例正常儿童作为对照组，以1 8 例确诊为P N S 的患儿作为观察对象，采用液相蛋白芯片系统，对肾病组患儿口服强的松治疗前后的血清及尿中的I L 一8 、I L 一1 3 水平进行测定，并检测肾病组患儿治疗前的2 4 小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇和甘油三酯，以分析1 0 8 、I L 1 3 与它们的相关性。结果：1 肾病组治疗前血清I L - 8 、I L 一1 3 水平【( 4 3 0 士1 5 0 ) p g ，m l 、( 4 0 8 4 土0 5 1 ) p g m 1 ) 】和相应对照组 ( 4 6 士O 7 3 ) p g ，m l 、( 4 0 7 7 士O
3、2 4 ) p g ，m 1 ) 】比较无显著性差异( p O 0 5 ) ；治疗后血清I L 一8 、I L 1 3 水平【( 4 5 6 士l - 2 0 ) p m l 、( 4 0 7 7 士O 2 4 )p m 1 ) 】和治疗前比较无显著性差异( p O 0 5 ) ；治疗后血清I L - 8 、I L 1 3 水平和对照组比较无显著性差异。2 肾病组治疗前尿I L 一8 、I L 一1 3 水平 ( 5 7 3 士2 4 6 ) p g m l 、( 4 1 2 2 土0 ，5 7 ) p m 1 ) 】和相应对照组【( 2 5 9 士0 2 2 ) p g ，m 1 、( 4
4、0 6 2 士O 0 9 ) p g ，m 1 ) 】比较有显著性升高( p 1 0 个高倍视野；反复出现高血压( 学龄儿童 1 3 0 9 0 m m H g ，学龄前儿童 1 2 0 8 0 m m H g ) ；持续性尿素氮 1 0 7n l m o l L ；血总补体C H 5 0 或血C 3 反复降低。肾病组病例不包括l 肾综继发于全身疾病者，无使用激素史或3 个月内无使用激素，排除呼吸道、消化道、皮肤等部位感染。初发者1 4 例，再发者4 例。单纯性肾病1 1 例，肾炎性肾病7 例。研究对象分为肾病组治疗前( 用激素前) 和治疗后( 口服强的松治疗8 周后，尿蛋白转阴并排除感染征象
5、) 及对照组2 0 例( 与肾病组相匹配的同年龄、同性别的健康体检儿童) ，其中男1 2 例，女8 例，年龄1 岁1 1 月至1 1 岁，平均4 9 岁。炎症园子I L 8 和抗炎症因子I L 一1 3 在原发性肾病综合征患儿血、尿中的检测及其临床意义2 4 2 检验原理：本实验所采用的液相蛋白：苎= 片方法是B i o s o r c e 多种磁珠( 即球形基质) 免疫检验法，在L u m i n e x l 0 0 T M 设备上完成分析。其检验原理如下：1 用吸管吸取磁珠( 结合到待测I L 8 或I L 1 3 的捕获抗体上的具有特定光谱的磁珠) 和样本( 包括已知I L 8 或I L
6、 1 3 浓缩物的标准品；对照组样本；肾病组待测I L 一8 或I L 1 3 浓缩物的样本) 到有滤过底的微板孔内，孵育2小时，在这第一个孵育过程中，待测I L 8 或I L 。1 3 在磁珠上结合到捕获抗体上。2 ，清洗磁珠后，加入特定的待测I L - 8 或I L 一1 3 生物基检测抗体( 即探针分子) ，和磁珠一起孵育1 小时。在这第二个孵育步骤中，待测I L 8 或I L 一1 3 生物基检测抗体识别其亲和体，并且结合到专门固定的待测I L - 8 或I L 1 3 上。3 除去多余的生物基检测抗体后，加入链霉胺一R 藻红蛋白( 即结合荧光蛋白R 藻红蛋自的链霉胺，也就是报告分子)
7、 孵育3 0 分钟。在这最后一个孵育过程中，链霉胺一R 藻红蛋白结合到生物基检测抗体上，在磁珠上形成免疫复合物，构成四重液相“三明治”结构。4 清洗去除未结合的链霉胺一R 藻红蛋白，就可以用L u m i n e x l 0 0 “设备来分析磁珠了。通过检测磁珠的光谱特性和相关的R 一藻红蛋白的荧光数量，就能够确定待测I L 一8 或I L 一1 3 的浓缩物了。2 4 3 检验步骤：l ，预湿指定检验的板孔：用吸管吸O 2 m L 的工作清洗液加入指定板孔内，等待2 0 秒后，用抽真空机从板孔里吸出工作清洗液。2 在轨道振荡器上将稀释的磁珠溶液振荡3 0 秒后，用吸管吸取2 5pL 磁珠溶液
8、加入每个板孑L ，并用锡纸包住板，保持避光。3 加o 2 m L 工作清洗液入板孔，让磁珠浸透2 0 秒，然后用抽真空机从板孔里吸出工作清洗液。重复这一清洗步骤，然后用干净的纸巾吸干扳底的剩余液体。炎症因子I L 一8 和抗炎症因子I L 一1 3 在原发性肾病综合征患儿血、尿中的检测及其临床意义图1 5 一图1 8 ：肾病组血、尿I L _ 8 及I L 1 3 与总胆固醇的相关性图1 5肾病组血清I L 电与总胆固酵的相关性图1 7* 目镕F m * b 聃女十( 9 一m I肾病组血清I L 1 3 与总胆固醇的相关性肾癣目黼m 镕l L 1 3 m 十( 阻，H2 6图1 6肾痈组尿I
9、 L 8 与总胆固酵的相关性击 奇 銎目疆*炎症因子I L 一8 和抗炎症因子I L 1 3 在原发性肾病综合饪患儿血、尿中的检测及其临床意义3 1 _ 3 肾病组患儿血及尿I L 8 、I L 1 3 水平与各生化指标的相关性肾病组血清及尿I L - 8 、I L 一1 3 分别与2 4 小时尿蛋白定量、血清白蛋白、血清总胆固醇、甘油三酯无显著相关性。( 见表3 )表3肾病组血及尿中I L - 8 、I L 1 3 ( p g m 1 ) 与各生化指标的相关性( r )注：r 为直线相关系数：a 为p 0 l ；b 为0 0 5 肾癍组血癌扛- 一1 3 与甘油三酶的相关陛i n 断n n
10、n 啦 十t 目，m I 图2 0肾病组屎I L 8 与甘油三酯的相关性图2 2肾痔组治疗前屎碍的水平( p 吖嘣】肾病组屎I L 1 ，与甘油三酯的相关性肾病蛆治疗前辰I o l 3 的水平( 舯1 )炎症因子I L - 8 和抗炎症因予I L 1 3 在原发性肾病综合征患儿血、尿中的检测及其临床意义B s A ( B s A 组) 后其量显著升高，但血浆仍测不出I L - 8 活性。并且他们用肾脏免疫组化的方法进行研究后显示，几乎所有的病变肾小球均可见单核细胞和系膜细胞有I L - 8 染色阳性，而未注入B s A 的兔的正常肾小球细胞则无I L 8 ，提示I L 8由肾小球局部产生。而I
11、 L - 8 通过诱导自细胞，尤其是中性粒细胞浸润参与肾脏损伤的过程。这说明除浸润的粒细胞外，肾小球系膜细胞、内皮细胞也可能是I L - 8的来源。他的研究还表明B s A 组兔经抗I L - 8 单克隆抗体处理后，尿蛋白量急剧减少，甚至达到正常水平，更进一步证实了I L _ 8 在该模型中致病作用的推论。w a d a 等H 们还对多个临床l 肾脏疾病病例( 包括肾病综合征) 的尿和血浆I L _ 8 水平进行测定，血浆I L 8 均无法测出，而尿I L 一8 水平则有不同程度的增加，这也提示I L - 8 在肾脏局部产生。他们认为，病变肾小球产生的I L _ 8 参与了肾脏损伤的过程，检测
12、尿I L 8 可反应肾脏局部炎症及监测疾病活动。由此可以看出，测定尿I L - 8 水平可能比测定血清( 浆) 或P B M c 释放的I L 8 水平更具有临床及理论意义。综上所述，我们认为P N s 患儿尿I L - 8 水平升高可能主要因为肾内的分泌增多，并由此推测针对性地局部给药肾动脉灌注或肾脂肪囊内注射或皮质激素基因的局部植入可能是本病治疗上另一有益途径。3 2 2I L 1 3 在原发性肾病综合征发病机制中的意义1 血I L 1 3 在原发性肾病综合征发病机制中的意义尽管有人提出1 0 t 2 8 咖、L 一1 3 可作为抗炎症因子在P N S 发病机制中发挥作用，但是本研究结果表
13、明：肾病组治疗前血清I L - 1 3 水平与对照组比较无显著性差异，与治疗后比较亦无显著性差异。与I L - 8 一样，I L 1 3 可能并非作为直接因素在P N S 发病机制中发挥作用。2 尿I L 一1 3 在原发性肾病综合征发病机制中的意义有关尿I L 1 3 在P N S 中作用的临床研究报道较少。我们的试验揭示肾病组炎症因子I L 一8 和抗炎症因子I L 1 3 在原发性肾病综合征患儿血、尿中的检测及其临床意义血清I L 一8 及I L 1 3 与总胆固醇、甘油三酯亦无相关性，显示血清炎症因子I L _ 8 及抗炎症因子I L 一1 3 与P N S 的病理生理改变无直接的联系
14、，进一步提示炎症因子I L _ 8 及抗炎症因子I L 1 3 不是参与P N S 发病机制的直接因素。总胆固醇、甘油三酯升高继发于P N S 的尿蛋自渗出，作为P N S 的生化改变，主要受原发性全身性因素的影响。而尿I L 8 、I L 1 3 是继发性局部性因子，故不表现与总胆固醇、甘油三酯有相关性。3 2 4I L 一8 与I L 1 3 在P N S 病变中的关系I L - 8 是P N S 病变中的致炎因子，I L 1 3 是抗炎因子。它们之间以及I L 与其他细胞因子之间存在复杂的网络关系，其问既有相互诱生，又有反馈抑制的现象。一种I L 的活性水平可因其他因子的活性水平变化而波
15、动。I L 8 、I L 1 3 的表达与肾脏病理形态的改变还可能存在一定的关系1 2 7 1o 这些都可能从一个侧面解释I L研究结论的差异。而且P N S 中，T H l 类和T H 2 类淋巴因子产生有重叠，不能用单一的T H l 或T H 2 亚群过度活化解释，P N S 淋巴因子产生异常可能是某些T H细胞克隆活化异常所致 4 2 1 0 综合以上的研究及讨论，我们认为P N S 患儿存在持续的细胞因子紊乱和细胞因子网络失衡，循环中的I L - 8 可能不是特异地引起P N S蛋白尿的致病因子，而I L 1 3 也可能不是P N S 中特异的抗炎症因子；I L 8 、I L 1 3在
16、P N S 病变中可能互为因果关系，但不是简单的因果关系，体现出炎症反应的瀑布效应。其之间的关系需要进一步从分子生物学的层次加以探讨。而P N S 患儿尿I L 8 、I L 1 3 升高可能都是因为肾内分泌引起，说明P N S 病变中既有炎症因子也有抗炎症因子的参与，显示机体有自我防御保护功能。3 2 5 肾上腺皮质激素在P N S 中对I L 一8 和I L 1 3 的影响动物实验己证实m 1 ，糖皮质激素对细胞因子有明显抑制作用。激素能够抑制单核细胞I L 8 m R N A 的表达和蛋白产物，从而进一步抑制白细胞和单核巨噬细胞的趋化、浸润，减轻肾组织的炎症反应性损伤；肾病综合征患者经免疫抑制剂治疗后，免疫状态相对稳定。激素能改变小血管的通透性和淋巴细胞表面分子结构，使循环池内淋巴细胞再分布，外周血淋
