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1、DNADNA- -蛋白质相互作蛋白质相互作 用研究技术用研究技术一、DNA结合蛋白及结合位点 的研究（一）凝胶阻滞实验技术： 鉴定启动子中与特异蛋白质的结 合部位、结构特征，以及特异蛋白 质的纯化与功能分析、调控效应等.生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 加加DNA结合蛋白结合蛋白生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 在离体条件下，菠菜叶绿 体蛋白与高粱psbA基因启 动子“-35”元件(TTGACA) 及其突变体(ATTACT)的结 合效应：A自由DNA探针；BF
2、 逐步增加野生型DNA探针量 而保持菠菜叶绿体蛋白提 取物量不变；G以突变子 ATTACA作为DNA探针，蛋白 质的量同F值科学通报科学通报 VOL- 44- 99- 12，吴乃虎等，吴乃虎等生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 菠菜叶绿体蛋白质 提取物与高粱psbA 启动子DNA的竞争 结合实验： AE未标记的 竞争DNA量分别是 标记DNA探针量的 1，5，10，30，50 倍。科学通报科学通报 VOL- 44- 99- 12，吴乃虎等，吴乃虎等生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专
3、心做生物专心做生物 （二）足迹技术研究（二）足迹技术研究DNA结合蛋白的结合蛋白的 结合位点结合位点足迹法技术用于测定与特殊蛋白质 结合在DNA上的结合位点和相应的核苷 酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与 启动子之间相互作用的信息并确定了作 用位点（启动子）的核苷酸顺序。生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 生物秀-专心做生物
4、生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 由含由含 70RNA多聚酶全酶识别的典型大多聚酶全酶识别的典型大 肠杆菌启动子肠杆菌启动子生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 二RNA干扰技术 （ RNA interference， RNAi ）RNA干扰是与靶基因序列同源的双链 RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默转录后基因沉默 现象. 它是一种跨越多种种属的古老的生物途径, 同时它的出现为生物学家提供了一种快速、 简便的反向遗传学技术,在后基因组时代功能 基因的研究中具有重要的应用前景.
5、生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 （一）（一）RNAi的发现的发现 1990 年,为加深矮牵牛花 ( petunias) 的紫 色,Jorgensen 等导入了一 个强启动子控制的色素基 因。结果许多花瓣颜色并 未加深,反而呈杂色甚至 白色。这是由于转基因和 同源的内源基因的表达都 被抑制了，Jorgensen 把 这个现象命名为共抑制 (cosuppression) 。P35S色素基因色素基因Ti质粒质粒 色素色素 基因基因重组重组转化转化繁殖繁殖生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀-
6、-专心做生物专心做生物 1998 年,Andrew Fire 等在秀丽隐杆线虫(C. elegans) 中的研究证明,在正义RNA 阻断基因表 达的试验中,真正起作用的是双链RNA (double- stranded RNA, dsRNA) 。他们将dsRNA注入线 虫体内后可抑制序列同源基因的表达, 并证实 这种抑制主要作用于转录之后, 所以又称RNAi 为转录后基因沉默( postt ranscriptional gene silencing ，PTGS) 1999 年, Hamilton 等在植物基因沉默的研究中 首次发现,2125nt 的dsRNA的出现对转基因导 致基因沉默十分重要
7、,而在转基因正确表达的植 株中则未出现。生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活 性实验，证明了这些小分子双链RNA （siRNA）在RNAi 中的作用。 随后人们陆续在果蝇(Drosophila) 、锥虫 ( Trypanosomes) 、涡虫( Planaria) 、斑马 鱼( Zebrafish) 、拟南芥(Arabidopsis thaliana) 、大小鼠和人体内发现了RNAi 现象。生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做
8、生物 （二）（二）RNAi的作用原理的作用原理双链RNA（ dsRNA ） (外源的或体内产生的) 首先被降解为具5单磷酸、长2123bp 的小分子 双链RNA , 这种RNA小分子称为小干扰RNA（ Small Interfering RNA ，siRNA） 。 siRNA具相似的结构特征: 为长约2123bp 的 双链RNA ,具5单磷酸和3羟基末端, 互补双链的 3端均有一个23nt 的单链突出。生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 1. siRNA的产生的产生一种称为Dicer 的核酸酶负责将dsRNA 转化 为siRNA
9、 。 它属于RNase 家族,具有两个催化结构域、 一个解旋酶( helicase) 结构域和一个PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域, Dicer 在催化过程中 以二聚体的形式出现, 其催化结构域在dsRNA 上反平行排列, 形成四个活性位点, 但只有两侧 的两个位点有内切核酸酶活性, 这两个位点在 相距约22bp 的距离切断dsRNA , 各种生物体内 Dicer 结构略有不同, 致使siRNA 长度存在微小 差别。生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区 生物秀生物秀- -专心做生物专心做生物 Dicers生物秀-专心做生物 生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区
