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1、复旦大学博士学位论文叶酸高分子复合物靶向抗肿瘤药效及机理的探讨姓名：韩慧兰申请学位级别：博士专业：药剂学指导教师：陆伟跃20040508中文摘要叶酸高分子复合物靶向抗肿瘤药效及机理的探讨摘要叶酸( F o l i ca c i d ) 是一种分子结构中含有喋呤环的小分子维生素，为真核细胞单碳代谢和核昔合成所必需。动物细胞缺乏叶酸生物合成的关键酶，它们只能依赖细胞表面的叶酸特异结合蛋白( 即叶酸受体，F o l a t er e c e p t o r s ) 主动摄取外源性叶酸来维持正常的生命活动。近5 0 年来的叶酸受体的研究表明，叶酸受体既广泛分布在正常组织，又分布在肿瘤组织中，其不同点在
2、于，多数肿瘤细胞叶酸受体的数量和活性远远超过正常细胞。目前，肿瘤细胞叶酸受体受到广泛关注，已成为肿瘤诊断和治疗研究的新靶点。肿瘤细胞表面的叶酸受体及叶酸受体介导的叶酸高分子复合物的肿瘤靶向性是本研究的主题。本研究的主要目的在于结合体内外抗肿瘤活性试验，从组织、细胞和分子水平探讨并初步确立叶酸一右旋糖酐复合物类药物靶向抗肿瘤机理，为叶酸一右旋糖酐复合物作为抗肿瘤药物的后续研究提供理论依据。本研究的主要内容包括：常规细胞培养基和实验动物饲料中叶酸含量的调整；叶酸高分子复合物抗肿瘤谱的筛选；叶酸一右旋糖酐复合物抗肿瘤活性初步研究；叶酸一右旋糖酐复合物靶向抗肿瘤机理的初步探讨：其它叶酸商分子复合物作为
3、介导叶酸受体靶向肿瘤细胞药物或药物载体的可能性探讨：防御素对肿瘤细胞作用的初步探讨。集落形成法考察不同浓度叶酸培养液对肿瘤细胞生长的影响结果表明，在一定浓度范围内，H e l a 2 2 9 细胞集落形成率随叶酸浓度的增加而急剧增加，当口；酸浓度达到4 5 3 1 n m o l L 时逐渐趋于饱和。使用人体生理条件下叶酸浓度的培养液时的集落形成率为7 3 左右，不影响细胞维持正常生理功能。这为后续的叶酸受体分析和药效学研究中低叶酸培养液，提供了依据。通过放射免疫法测定市售实验动物饲料中的叶酸含量，调整饲料中的叶酸含量，并考察其对小鼠血清浓度和生长的影响。结果表明，与普通饲料相比，使用低叶酸饲
4、料后，动物的血清叶酸浓度虽然降低显著( p 6 0 f m o l 10 6 c e l l 1 ：T h eK Dv a l u e so ff o l a t er e c e p t o r so fd i f f e r e n tc e l l sw e r ea l l N - 5 一甲基四氢叶酸 N - 5 甲酰基四氢叶酸，氨甲蝶呤等。叶酸受体对这些配体均表现出立体特异性，但受体的结合位点存在较大差异。利用这一点，可以设计出介导叶酸受体的抗肿瘤药物，这对治疗癌症时减少非靶器官的摄入和药物的毒副作用有非常重要的意义。3 、叶酸复合物极其肿瘤靶向诊断及其治疗中的应用3 1 叶酸复合物
5、的作用特点叶酸可通过其v 羧基部分连接到治疗药物或显像剂药物分子上，而其与细胞表面受体的亲和力保持不变。通过这个特性，可向肿瘤组织传送多种靶向诊断和治疗药物，可以通过叶酸受体内吞途径将叶酸复台物无破坏性携带入细胞内1 2 “”( 图3 ) 。图3 叶酸受体介导的叶酸复合物的内吞机理示意图国外学者研究发现，叶酸复合物对肿瘤细胞表面的叶酸受体亲和力很高，类似于叶酸与叶酸受体的亲和力( K d = 1 0 。o m o l L ) ，因此，叶酸复合物可以循叶酸前言受体途径被相关肿瘤细胞特异性摄取。鉴于选择叶酸受体识别并结合叶酸后被内吞入胞这一生理过程，此策略既不破坏药物分子，也不损害细胞本身，克服了
6、大分子药物在生理状态下不能穿透细胞膜进入细胞内的生理屏障。3 2 用于肿瘤靶向诊断和治疗的叶酸复合物目前国内外利用叶酸介导靶向肿瘤传送的分子复合物有蛋白质毒素 3 1 3 6 】、低分子量化疗剂5 6 - 6 0 1 、放射显像剂、磁共振显像剂、放射治疗剂 3 7 5 5 】、包裹药物的脂质体7 ”、基因【7 5 8 3 1 、反义寡核苷酸 8 4 - 8 5 】、核糖酶和免疫治疗剂【8 6 - 9 3 。这些叶酸复合物的体外活性研究表明，与同样制剂的非靶向形式相比，其效能和靶向性有明显的提高。叶酸作为叶酸受体的配体与放射性核素直接通过小分子间接连接而成的复合物，在肿瘤影像诊断方面的动物实验结
7、果表明，肿瘤部位靶向效果显著；叶酸间接与脂质体表面结合生成的叶酸一聚乙二醇脂质体细胞培养和动物实验结果表明，其靶向肿瘤细胞效果明显好于P E G 一脂质体或普通脂质体。叶酸与高分子复合物也可通过叶酸受体将高分子完整地传释至细胞内的非溶酶体浆质中。如与叶酸复合的牛血清白蛋白、牛免疫球胆白、辣根过氧化酶、核糖核酸酶、豆丝氨酸酶抑制剂和抗D N A 寡核苷酸均能明显导入K B 细胞、H e L a细胞和X C 细胞而发挥其相应效果：结合叶酸的抗T 细胞受体单克隆抗体或抗F c 受体单克隆抗体能将肿瘤细胞与T 细胞或天然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞紧密地撮合在一起，达到有效溶解肿瘤细胞目的；而具有抑制
8、蛋白合成功能的毒素f 木鳖子皂甙( M o m o r d i n ) 一种只有透过核糖体到达细胞浆才表现出细胞毒性的蛋白毒素；假单胞菌外毒素片段( L y s P E 3 8 和C y s P E 3 5 ) 与叶酸复合后，其抑制肿瘤细胞生长能力极大增强。总而言之，迄今为止国外文献报道的叶酸复合物研究大致分为两大类型。其一，叶酸与化疗药物、放射影像剂、治疗用抗体、基因等治疗和诊断药物直接连接，以叶酸作为靶向头基，将目标化合物传释至靶细胞。其二，将叶酸与脂质体等连接在一起作为药物的复合载体，将治疗药物运输到叶酸受体表达过多的靶细胞。目前，国外这方面研究处于动物试验或早期临床试验阶段，国内有关叶
9、酸复合物研究报道很少，只见本课题组发表的研究论文。但尚未见国内外有关本研究中涉及的叶酸右旋糖酐复合物、叶酸一羧甲基化右旋糖酐复合物及其衍生物、叶酸一聚乙二醇复合物及其衍生物的有关抗肿瘤活性和机理的报道。( 三) 本研究中所用叶酸高分子复合物简介1 、叶酸右旋糖酐复合物及其羧甲基化衍生物叶酸右旋糖酐复合物是一种具有自主知识产权的受体型抗肿瘤化合物，其是由原本无抗肿瘤活性的右旋糖酐与叶酸以共价键方式连接而成的叶酸高分前言子复合物，也是本研究中的主导化合物。其中的高分子原料右旋糖酐( 又名葡聚糖) 是一种由蔗糖通过肠膜状明串珠菌发酵而制成的D - 葡萄糖聚合物。所用菌种不同，产生的右旋糖酐中葡萄糖基
10、连接方式有所差异，但主要以。【1 ，6 键连接为主，其余为0 l 一1 ，4 或1 ，3 键。动物实验和临床试验追踪结果均表明，输注右旋糖酐后，动物实质性器官未见异常和组织损伤，人体肝、脾、肾、肺等器官未见右旋糖酐蓄积。临床上，右旋糖酐主要作为血容量扩胀剂和血液流动性改善剂，用于：失血性休克、烧伤和肝肾综合征，急性血栓、血栓性闭塞脉管炎，心肌梗塞，全身性硬化症等。鉴于右旋糖酐生物特性及其分子结构的多羟基特点，其曾被作为各种药物的载体，以达到增强药物的化学稳定性，或提高药物生物有效性，或用于淋巴系统疾患诊断的目的。这些右旋糖酐一药物复合物包括：右旋糖酐锑、右旋糖酐铁、右旋糖酐胰岛素、右旋糖酐一柔
11、毛霉素、右旋糖酐丝裂霉素、右旋糖酐维生素、右旋糖酐甲氨喋呤、右旋糖酐毡( 或B ) 一淀粉糖化酶( 或胰蛋白酶) 、右旋糖酐硫酸酯、放射性锝( ”T c ) 右旋糖酐。其中本研究室研制开发的主要用于淋巴系统疾患定位和肿瘤淋巴转移辅助诊断的9 9 T c 一右旋糖酐1 0 5 注射液及其注射用亚锡右旋糖酐1 0 5 已正式生产和临床使用。右旋糖酐有很高的水溶性。各种不同分子大小且分布均一的右旋糖酐可以很方便地获得，而且聚合物中含有大量的羟基使得药物或蛋白质等可很简便地共价连接。因此，右旋糖酐是一种很好的高分子载体，可用作药物、显像剂、蛋8 酶的传送系统。初步研究表明，右旋糖酐与叶酸形成复合物以后
12、，能明显抑制肿瘤细胞生长、显著抑制移植瘤裸鼠模型的肿瘤生长、且未表现出明显毒副作用，故有望作为抗肿瘤新药( 西药一类) 进行研究开发。2 、叶酸羧甲基化右旋糖酐复合物及其衍生物叶酸右旋糖酐复合物抗肿瘤活性研究工作中发现，右旋糖酐趋肝性导致叶酸一右旋糖酐复合物的血浆半衰期较短，以及叶酸羧基与右旋糖酐羟基形成酯键的稳定性低，不利于叶酸右旋糖酐复合物充分发挥疗效。为进一步提高叶酸- 右旋糖酐复合物靶向性，将右旋糖酐羧甲基化，使其与叶酸中的氨基以酰胺键连接，以期达到改善叶酸右旋糖酐复合物血循环时间和稳定性目的，为进一步提高叶酸一右旋糖酐复合物靶向性奠定原材料基础。3 、叶酸聚7 - - 醇复合物及其衍
13、生物聚二醇化合物是一类具有- O ( C H 2 ) 。O 或- ( C H 2 ) 。o ( C H 2 ) 。，重复结构的线性聚二醇类高分子化合物，其中n 2 或n 1 。聚二醇化合物中最常见的是聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，P E G ) ，其分子组成为：前言H O C H 2 C H 2 ( 0 C H 2 C H 2 0 ) 。C H 2 C H 2 0 H 或H O C H 2 ( C H 2 0 C H 2 ) nC H 2 0 HP E G 既可溶解于水，又可溶解于绝大多数的有机溶剂，具有良好生物相容性和血液相容性，免疫原性
14、低，能被机体迅速排除而不产生明显毒副作用。在制药工业中，聚乙二醇可用作药物辅料以提高药物的各种性能，如分散性、成膜性、润滑性、缓释性等。在新型生物材料的合成和改性中，聚乙二醇作为材料的一部分，将赋予材料新的特性和功能，如亲水性、柔性、抗凝血性、抗巨噬细胞吞噬性等。在聚乙二醇的实际应用中，端基起着决定性的作用。聚乙二醇链末端不只限于羟基，其它反应活性更强的功能基团，如对甲苯磺酸酯、氮基、羧基、醛基等基团也可引入P E G 链的两末端。这些功能基团的引入，扩大了聚乙二醇的应用范围，使其在有机、多肽和高分子合成及药物的缓控释和靶向给药等方面具有广阔的应用前景。聚乙二醇修饰包括，聚乙二醇与生物大分子类
15、药物的物理结合和化学修饰，其可改变生物大分子的些性质，如：增加药物的溶解度和稳定性；减弱或消除免疫原性、抗原性和毒性：改善药物的体内药动学行为，延长药物在体内的半衰期；提高药物的治疗指数、扩大临床使用等。目前大部分研究主要集中在聚乙二醇与蛋白质的化学复合方面，如：干扰素、超氧化物歧化酶、粒细胞集落刺激因子、牛血红蛋白、水蛭素、肿瘤坏死因子、胰岛素、自介素2 、尿酸酶腺苷脱胺酶、天冬酰胺酶等本课题组以叶酸作为靶向头基与衍生化聚乙二醇通过酰胺键共价结合。叶酸的主动靶向性与聚乙二醇作为药物载体的优良性质结合可能成为新的具有靶向作用的肿瘤诊断或治疗的药物载体。同时，聚乙二醇的线性结构，有着比同样分子量
16、的多糖、蛋白或多肽更大的等效半径，因此，适当分子量的聚乙二醇能够在组织间隙不透过毛细血管而导入毛细淋巴管。共价结合于聚乙二醇的叶酸，可与淋巴系统中过度表达叶酸受体的肿瘤细胞结合，而使聚乙二醇及其所携带药物主动靶向肿瘤组织。此类研究国内外未见报道，其对淋巴系统转移性或原发性肿瘤的诊断和治疗具有非常重要的意义。因此，高分子聚合物与叶酸结合后是否具有与叶酸一右旋糖酐复合物同样的抗肿瘤活性，值得进一步研究。二、本课题的拟解决的问题l 、研究目的本研究将结合体内外抗肿瘤活性试验，从组织、细胞和分子水平探讨并初步确立叶酸右旋糖酐复合物类药物靶向抗肿瘤机理，为叶酸一右旋糖酐复合物作为抗肿瘤药物的后续研究提供依据。日U舌2 、研究内容第一章常规细胞培养基和实验动物饲料中叶酸含量的调整第二章叶酸高分子复合物抗肿瘤谱的筛选第三章叶酸一右旋糖酐复合物抗肿瘤活性初步研究第四章叶酸一右旋糖酐复合物靶向抗肿瘤机理的初步探讨第五章其它叶酸高分子复合物作为介导叶酸受体靶向肿瘤细胞
