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1、独创性声明独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内
2、容编入有关数据库进行检索，收录到中国学位论文全文数据库 ，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 。学位论文作者签名：指导教师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通信地址：邮编：I摘 要鸡球虫病是由艾美耳属的一种或多种球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内而引起的呈世界性分布的原虫病，该病对养鸡业危害十分严重。本试验选用玻璃纸胶囊单卵囊分离技术成功分离到一株球虫，并应用形态学和分子生物学方法进行了鉴定，最终鉴定为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西（AHFX）株；用所获球虫感染雏鸡，对雏鸡感染后不同
3、阶段血清生化指标的变化进行了研究。首先，从安徽肥西县某鸡场选择具有盲肠球虫病典型症状的病鸡，取病鸡盲肠内容物研碎后加生理盐水搅拌混匀，经 40 目铜丝筛和 260 目尼龙筛过滤，滤液经3000r/min，离心 10min，收集沉淀。向沉淀物中加入适量 2.5%重铬酸钾，置于 28恒温箱内培养至 85%以上卵囊孢子化，孢子化卵囊于 4冰箱保存备用。以玻璃纸为载体， 配合使用空胶囊进行球虫单卵囊分离，先将卵囊液稀释至每滴卵囊液中只含有12 个卵囊，沾取一滴置于 0.5cm0.5cm 的玻璃纸上，观察卵囊的形态学特征，而后置于空胶囊内，经口接种于 20 只 6d 龄雏鸡，接种后第 5d 开始检查粪样
4、中卵囊，以判断雏鸡球虫感染情况。随后，将上述单卵囊分离所获后代球虫（第一代） ，按 1104个卵囊/鸡的剂量感染 14d 龄无球虫雏鸡，每日观察鸡只精神状态，食欲状况，粪便变化。在喂服 115h后，每 2h 检查 1 次粪便，并记录最早出现卵囊的时间即最短潜在期，同时用沉浮法收集球虫卵囊（第二代） ，测定最短孢子化时间。分别随机测量 50 个第一代与第二代球虫卵囊，并对其大小进行差异显著性检验（F 检验） 。而后，漂洗、浓缩所获卵囊液，按照常规 DNA 抽提法进行球虫全基因组 DNA的提取。参照 Yao-Chi Su 等设计的引物：ET1：5-CGCTGCTGGTTTTACAGGTT-3，ET
5、2：5-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3进行 PCR 扩增，对 PCR 扩增产物进行序列测定和聚类分析。最后，将所获柔嫩艾美耳球虫安徽肥西（AHFX）株按照 5104个卵囊/只的剂量接种 80 只 21d 龄雏鸡，分别在感染后 0d、5d、9d 和 13d 心脏采血，测定平均体重、免疫器官指数和血清生化等指标。结果表明： （1）通过单卵囊分离技术感染雏鸡，在 20 只雏鸡中，有 5 只感染成功，其成功率达 25%。 （2）对单卵囊分离所获球虫进行增殖，其第二代卵囊大小为（17.023.6） m （15.820.3） m， 平均大小为 21.1 m18.0 m， 卵形指数为 1.17
6、，潜在期为 140h。将单卵囊所得球虫（第一代）与增殖后球虫（第二代）的球虫卵囊大小进行差异显著性检验（F 检验） ，结果显示差异不显著（P0.05） ，表明第二代球虫与第一代球虫卵囊大小相同，且各项其他形态学特征均符合柔嫩艾美耳球虫的特II征。因此初步鉴定本次所获球虫为柔嫩艾美耳球虫，暂命名为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西（AHFX）株。 （3）应用 PCR 方法，对所获球虫卵囊进行分子生物学鉴定，成功扩增出 463bp 的特异性片段； 通过序列分析发现所扩增的基因与已报道的柔嫩艾美耳球虫（GQ856310）同一基因片段的同源性高达 98.2%，并将测得序列上传至 GenBank，序列登录号为 JX
7、477100。 （4）用所获球虫卵囊进行雏鸡接种试验显示：与对照组相比，感染后第 5d 平均体重、血清 Na、TP 和 ALB 含量极显著降低（P0.05） 。综上所述，本研究应用单卵囊分离技术成功分离到一株艾美耳球虫，并通过形态学和分子生物学方法对其进行了鉴定，确定为柔嫩艾美耳球虫 AHFX 株；用该株球虫感染雏鸡，测定感染后血清生化指标，初步探明了柔嫩艾美耳球虫 AHFX 株感染雏鸡后不同阶段血清生化指标的变化规律。 本试验的研究结果可为安徽肥西县鸡球虫病的防治提供理论依据。关键词：鸡，柔嫩艾美耳球虫，单卵囊分离技术，鉴定，血清生化指标IIIAbstractCoccidiosis in c
8、hicken is caused by one or a variety of the coccidia that belonging toEimeria parasite on chicken intestinal epithelial cells, which is a worldwide distributionprotozoosis, can result in huge losses to the poultry industry. This trial successfullyisolated a strain Eimeria coccidia by using cellophan
9、e and capsule for the single oocystseparation, and finally identified it as Eimeria tenella Anhui Feixi strain (AHFX) usingmorphological and molecular methods; then infected chicks with the obtained oocysts thatsporulated, different stages of serum biochemical changes were studied of the infectedchi
10、ckens.Firstly, collected the cecal contents from the chickens that had a typical symptoms ofcecal coccidiosis from a chicken farm in Feixi County, Anhui; filtered by 40 mesh coppersieve and 260 mesh nylon sieve after mixing with saline, then collected the precipitate aftercentrifugating the filtrate
11、 10minutes at 3000r/min. Adding an appropriate amount of 2.5%potassium dichromate to the precipitate, cultured in 28C incubator for sporulation untilmore than 85% of the oocysts sporulated, sporulated oocysts stored at 4C refrigerator.Single oocyst separation was carried out with the cellophane and
12、empty capsules as thecarrier, diluted the oocyst liquid to each drop of oocysts solution containing only 1 or 2oocysts; dampened with a drop to the cellophane that in the size of 0.5cm0.5cm, observedthe morphological characteristics of the oocysts, and then placed in the empty capsules,inoculated to
13、 20 6-day-old chicks orally, started checking oocysts from the fecal afterinoculating 5 days to determine if the chicken had infected.Subsequently, the offspring of the single oocyst (first generation) were inoculated to14-day-old chicks in the dose of 1104oocysts per chicken, observed the mental st
14、atus,appetite availability and stool changes of the chickens daily. 115 hours after inoculation,checked the faces every 2 hours and recorded the time of first oocysts appeared and thepotential period; collected the oocysts (second generation) and recorded the minimumsporulation time. Randomly measur
15、ed 50 oocysts of the first generation and secondgeneration, tested the size difference (F test).Thereafter, extracted the coccidian genomic DNA according to a conventional methodafter rinsing and concentrating the oocysts solution. Designed primers with reference toYao -Chi Su: ET1: 5-CGCTGCTGGTTTTA
16、CAGGTT-3,IVET2:5-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3 for PCR amplification, sequencing andanalyzing cluster of PCR products.Finally, 80 21-day-old chicks were inoculated with the oocysts of Eimeria tenellaAnhui Feixi (AHFX) strain in the dose of 5104oocysts per chicken; after inoculation 0day, 5 days, 9 days and 13 days, took cardiac blood and measured average weight index ofimmune organ, and serum biochemical indicators.The results show that: (1) Five chickens were successfully
