《丹参酮ⅡA对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用及机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丹参酮ⅡA对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用及机制研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1丹参酮A 对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用及机制研究作者：杨萍，李杰，周凤华，李丽君，贾钰华【摘要 】 目的观察丹参酮A 对过氧化氢诱导的心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法采用差数贴壁法体外分离培养新生乳鼠心肌细胞，以 200 mol/L 过氧化氢作用 2 h 模拟心肌细胞氧化应激模型，分别以丹参酮A 高、中、低剂量在造模前干预 24 h。采用MTT 法检测细胞活力，流式细胞仪 Annexin V-PI 双染法检测细胞凋亡率，检测心肌细胞总抗氧化能力（T-AOC） 、LDH 活性、MDA含量、SOD 活力、GSH-Px 活力、CAT 活力。结果模型组心肌细胞经 200 mol/L 过氧化氢
2、作用 2h 后，细胞活力显著降低，凋亡率显著增高。与模型组比较，丹参酮A 显著增加心肌细胞活力，降低细胞凋亡率。过氧化氢可导致心肌细胞 LDH 活性及 MDA 含量显著增加，并使总抗氧化能力（T-AOC） 、SOD 活力、GSH-Px 活力、CAT 活力显著降低，丹参酮A 可呈浓度依赖性显著降低 LDH 活性及 MDA 含量，增加总抗氧化能力（T-AOC） 、SOD 活力、GSH-Px 活力、CAT 活力。结论丹参酮 A 可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞损伤，这可能与其增强细胞抗氧化酶活力，降低脂质过氧化反应有关。 2【关键词】 丹参酮A； 心肌细胞； 氧化应激ChinaAbstract：Obj
3、ectiveTo study the protective effect and mechanism of Tanshinone A on myocardial damage induced by hydrogen peroxide.MethodsPrimary cultured neonate rat myocardial cell was cultured in medium with 200mol/L hydrogen peroxide, and the medium was supplemented with different concentrations of Tanshinone
4、 A in advance. Cell viability was determined by MTT method. Annexin V/PI bivariate dyeing was used to detect apoptosis rate. Besides, T-AOC, LDH, MDA, SOD, GSH-Px, CAT were detected to evaluate cell antioxidant ability.ResultsIn model group, cell viability decreased significantly and apoptosis rate
5、rose significantly compared with normal group. Compared with model group, Tanshinone A increased cell viability and decreased apoptosis rate in a dose-dependent manner. Compared with normal group, LDH and MDA increased remarkably, and T-AOC, SOD, GSH-Px, CAT were dropped remarkably in model group. C
6、ompared with model group, Tanshinone A decreased LDH and MDA significantly ,and increased T-AOC, SOD, GSH-Px, CAT significantly in a dose-dependent manner. ConclusionTanshinone A can reduce 3myocardial damage induced by hydrogen peroxide, the mechanism may be related with the enhancement antioxidase
7、 activity, and decrease of lipid peroxidation.Key words：Tanshinone A; Myocardial cell; Oxidative stress随着冠状动脉内溶栓、冠脉球囊扩张及冠脉搭桥等内外科治疗缺血性心脏病手段的广泛应用，在恢复缺血心肌的再灌注挽救缺血心肌的同时，缺血/再灌注( Ischemia/reperfusion, I/R)损伤所带来的问题日益明显1 。许多实验研究已证明，在心肌损伤区有大量自由基产生，自由基产生的氧化损伤是心肌损伤的重要因素，而应用自由基清除剂可以减轻组织细胞的损伤2 。丹参是我国的传统中药，被广泛用于冠
8、心病的治疗。丹参酮A（ tanshinone,TSN）是丹参最重要的生物活性部分3 。本实验以体外培养的乳鼠心肌细胞为基础，以 H2O2 诱导细胞损伤为模型，旨在研究丹参酮A 在氧化应激条件下对心肌细胞的保护作用，探讨其可能的作用机制，阐释丹参治疗心肌缺血性疾病的机理。1 材料41.1 动物出生 13 d 雄性 Wistar 大鼠，SPF 级，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号 SCXK 粤-20060015。1.2 药品与试剂胎牛血清购自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM 培养基购于 Gibico 公司；丹参酮A 购于中国药品生物制品检定所（批号 110766-200417）
9、；乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶 (SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） 、过氧化氢酶(CAT) 测定试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。2 方法2.1 分组原代乳鼠心肌细胞经分离、纯化后进行实验分组，分为以下几组：正常组：培养的正常心肌细胞培养；模型组：心肌细胞培养液中添加 200 mol/L H2O2 作用 2 h；丹参酮A高剂量组：心肌细胞用丹参酮A 110-4mol/L 培养 24h 后添加200 mol/L
10、H2O2 继续作用 2 h。丹参酮 A 中剂量组：心肌细胞用丹参酮A 510-5mol/L 培养 24 h 后添加 200 mol/L 5H2O2 继续作用 2 h。丹参酮A 低剂量组：心肌细胞用丹参酮A 110-5mol/L 培养 24 h 后添加 200 mol/L H2O2 继续作用2 h。2.2 新生大鼠心肌细胞培养参照 Goldenberg 等4方法略加改进。取出生 1 3 d SD 乳鼠，在 75酒精中浸泡 8s 后取出，固定四肢。用无菌眼科剪剪开胸部，无菌眼科弯镊取出心脏。迅速将心脏放入装有冷 D-Hanks 液的培养皿中，去除心房及心外膜的结缔组织，将心室剪开，洗净残血，反复洗
11、 3 次。将心室肌在无菌培养皿侧壁剪碎成 12 mm3 的小组织块。将小组织块移入 50 ml 塑料离心管中，加入 0.1胰蛋白酶 5ml，37消化 6 min。自然沉淀后去除第 1 次上清，再加入 5 ml 胰蛋白酶于 37 消化 6 min 后，轻轻吹打，自然沉淀后，取上清移入 15 ml 离心管中，加含血清培养基终止消化，1 000 r/min 离心 10 min，洗两次。剩余沉淀继续加胰蛋白酶消化，如此反复消化 710 次直至组织块完全消化。将离心所得沉淀用含 15胎牛血清的培养基制成细胞悬液，在 CO2培养箱中差速贴壁 1 h，去除非心肌细胞（主要是成纤维细胞和内皮细胞） 。1 h
12、后轻轻吸出细胞悬液，调整细胞密度，将心肌细胞悬液均匀接种于 6 孔板内，置于二氧化碳培养箱中培养。前 48 h 加入终浓度为 0.1 mmol/L 的 5-溴脱氧尿苷，每 24 h 换液 1 次。2.3 心肌细胞活力检测 采用 MTT 比色法测定心肌细胞活力。6心肌细胞悬液以 1.5104/ml 接种于 96 孔板。分组处理后，每孔加入 20 l MTT（5 mg/ml） ，在培养箱中 37孵育 4 h。吸去上清，每孔加入 DMSO 150 l。微孔振荡器上振荡 10 min。酶标仪检测 570 nm 波长的吸光度值。每孔 OD 值减去空白孔 OD 值为测试孔 OD 值。活细胞数与 OD 值成
13、正比。每组每个时间点设 6 个复孔，取其平均值。2.4 心肌细胞凋亡吸出培养液，D-Hanks 洗细胞 3 次，5 min/次。向培养瓶中加入 23 ml 0.125胰蛋白酶（使用前应预热至 37左右） ，镜下观察细胞，待其变圆，细胞间分离但尚未脱落时倒去胰酶，加入原培养液终止消化，吹打瓶壁，使细胞脱落。将细胞悬液转移至离心管，1 000 r/min 离心 5 min，加 PBS 重悬细胞，调整细胞浓度为 1106/ml，取 0.5 ml 上述细胞悬液，1 000 r/min 4 min 离心，弃上清，加 0.5 ml Binding Buffer 重悬细胞，加入 1l 荧光标记的 Aanne
14、xin V 试剂，混匀后避光室温下孵育 20 min。加入 5l PI 混匀后避光 4 下孵育 5 min，孵育后加入500 l Binding Buffer，立即上流式细胞仪分析，激发波长Ex=488 nm; 发射波长 Em=530 nm。2.5 总抗氧化能力及氧化平衡体系酶测定采用比色法测定总抗氧化能力（T-AOC） ，采用 2,4-二硝基7苯肼显色法检测 LDH 活性，硫代巴比妥酸法测定 MDA 含量，黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 活力，二硫代二硝基苯甲酸法测定 GSH-Px含量，钼酸铵法测定 CAT 活力。具体操作步骤参照试剂盒说明书。2.6 统计分析计量数据以均s 表示，采用 SPSS
15、13. 0 统计软件进行分析。多组数据间比较采用单因素方差分析 (One Way ANOVA)处理，组间两两比较采用 LSD 法。检验显著性水准 0.05。3 结果3.1 丹参酮A 对过氧化氢所致心肌细胞损伤的细胞活力与细胞凋亡的影响与正常组比较，模型组心肌细胞活力显著降低，细胞凋亡率则显著增加；在改善细胞活力方面，丹参酮A 高剂量组细胞活力较模型组显著增高，而丹参酮A 中剂量、低剂量 与模型组比较无统计学差异。在改善细胞凋亡率方面，丹参酮A 各剂量组细胞凋亡率均显著低于模型组，中剂量与低剂量差异无统计学意义。结果见表 1。表 1 丹参酮A 对过氧化氢所致心肌细胞损伤细胞活力及细胞凋亡率的影响
16、（略）3.2 丹参酮A 对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力的影响与正常对照组比较，模型组心肌细胞总抗氧化能力、SOD 活性、8GSH-Px 活性、CAT 活性显著降低，而 LDH 活性、MDA 含量则显著增加；丹参酮A 可呈剂量依赖性增加总抗氧化能力、SOD 活性、GSH-Px 活性、CAT 活性，降低 LDH 活性、 MDA 含量。结果见表2。表 2 丹参酮A 对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力4 讨论在 I/R 时可产生大量的活性氧自由基，是 I/R 介导细胞结构损伤和功能代谢障碍的重要途径之一5 。许多实验研究已证明心肌缺血再灌注损伤不仅引起细胞坏死，而且也诱导细胞凋亡6 。心肌细胞的过度凋亡会导致心肌细胞数量的减少以及心肌结构破坏和功能障碍。本研究结果显示，外源性 H2O2 200mol/L 可以导致心肌细胞活力显著降低，凋亡发生率
