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1、YuryPopov, Detlef Schuppan. Targeting liver fibrosis: Strategies fordevelopment and validation of antifibrotic therapies. Hepatology, 2009, 50(4): 1294-1306.1肝纤维化靶点：发展策略及抗纤维化方法的验证肝纤维化靶点：发展策略及抗纤维化方法的验证Yury Popov and Detlef Schuppan摘要：摘要：我们对肝纤维化及肝硬化的生物化学及细胞生物学的理解已经取得了重大进步，其中包括预防及逆转纤维化的策略和药物的研发。 但是， 把这
2、些知识应用到临床实践中却受到阻碍， （1）确认纤维化机制和研究抗纤维化药物的多种体内外模型的限制， （2）缺乏高灵敏度的方法来评定肝纤维化程度及患者纤维化进展及逆转的动力学。 还有， 无论肝硬化还是持续性的失代偿都难以确定临床终点， 单纯的纤维化和纤维化进展几乎难以找到临床进一步恶化的替代指标。 这篇综述主要阐述临床前抗纤维化药物研发的最佳策略， 并强调现在和未来的技术允许无创检测评估和量化肝纤维化及其进展。 这种无创方法学的应用可以作为临床研发的起搏点，验证有潜力的抗纤维化药物。纤维化是发生于大多数慢性肝病的一种持续性的损伤愈合反应， 最终导致疤痕组织的沉积，例如过剩的细胞外基质（ECM）。
3、伴随持续性的肝损伤，肝纤维化可能进展为肝硬化，其特征为肝脏血管系统及组织结构的扭曲， 肝硬化是肝病患者的主要病因及死因， 归因于肝损伤与原发性肝癌1。原发病治疗，例如丙肝与乙肝的抗病毒疗法，或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的减重及运动疗法，可以延缓或阻止肝纤维化进展。但是，许多病人既不做原发病治疗， 也未检测晚期肝纤维化或肝硬化。 因为肝纤维化尤其是肝硬化是与肝脏相关的发病及死亡的主要预警器，迫切需要研发、检测和监测抗纤维化疗法是否可以预防、阻止甚至逆转肝纤维化或肝硬化。尽管在二十年前我们已经对肝纤维化病理学机制的理解有了重大进展， 但把这些知识应用于抗纤维化疗法却由于缺乏临床试验而停滞。 这
4、篇综述主要关注抗纤维化药物研发的现有挑战及陷阱，并为实现它们的临床验证而运用策略战胜阻碍。抗纤维化方法的有望靶点抗纤维化方法的有望靶点肝纤维化的形成是一个动态过程，其特征是纤维形成（ECM 的过剩合成和沉积）明显大于纤维移除（纤维消解）。因此，一旦刺激纤维产生的因素消除且纤维化消解优于合成，甚至晚期肝纤维化和肝硬化都有可能逆转。1-3肝星状细胞与肌纤维母细胞（共属 HSC）的复杂生物学，肝纤维化进程中过剩 ECM 的主要产生者，在近期综述中已被集中报道4。其他促纤维形成的非实质细胞可以上调活化的肝星状细胞。（表 1 中概述）表 1 肝纤维化形成过程中除 HSC/MF 外的细胞靶点YuryPop
5、ov, Detlef Schuppan. Targeting liver fibrosis: Strategies fordevelopment and validation of antifibrotic therapies. Hepatology, 2009, 50(4): 1294-1306.2细胞模型进展逆转参考文献巨噬细胞CCl4是是111B 细胞CCl4是？112NK 细胞DDC,CCl4是？113T 细胞(CD8+)CCl4是？114肝细胞BDL是？7上皮-间质转化（EMT）CCl4,BDL是？10,27骨髓衍生细胞CCl4是是8,115抗纤维化治疗的靶点是在纤维化进展或逆转中起
6、重要作用的细胞，信号转导途径和分子。他们可以最终导致（1）肝星状细胞活化和募集， （2）活化上调肝星状细胞活性的细胞，（3）促纤维化生长因子，细胞因子和其它介质，（4）HSC 内促纤维化途径和细胞上调他们的活性，（5）逆转已形成的纤维化的纤维消解途径的激活物。最近已证实，活化的肝星状细胞（肌纤维母细胞）可以衍生于门静脉周围或血管周围的成纤维化细胞5,6，骨髓衍生的循环的肝细胞7,8可通过肝损伤过程中的血管或上皮-间质转化途径（EMT）中的肝脏上皮所募集9,10（图 1）。然而，在大多数试验研究中肝细胞和 EMT 贡献了不多于 5%-10%的肌成纤维母细胞数目。 活化的胆管细胞的一个主要作用，
7、如与原粒子细胞相关的小胆管上皮细胞增殖，仅仅最近在纤维化形成中被证实。它们在纤维化形成时普遍存在，它们的增殖与任何病因学的慢性肝病进展相关。11,12活化的胆管细胞分泌纤维化生长因子，如转化生长因子（TGF）1, TGF2，结缔组织生长因子（CTGF），和可活化星状细胞的血小板衍生生长因子（PDGF）-BB13-16，重新表达纤维形成的整合素v617，产生 ECM 成分如基底膜蛋白18，并通过释放可激活 HSC 的配位子诱导胆道小板形成的早期程序。相应地，活化的 HSC 为邻近的胆细胞产生生长因子和存活因子，创建一个活性的纤维反馈环路。（图 2）YuryPopov, Detlef Schupp
8、an. Targeting liver fibrosis: Strategies fordevelopment and validation of antifibrotic therapies. Hepatology, 2009, 50(4): 1294-1306.3图 1. 肌纤维母细胞是肝脏中重要的纤维形成细胞。活化的肝星状细胞/肌纤维母细胞是同源细胞，由于静息的 HSC、肝成纤维细胞的转化而数量上升，由于 EMT 途径活化/损伤的肝上皮细胞和骨髓衍生循环的肝细胞而数量减少。这些肌纤维母细胞特征是持续增殖、迁移、收缩及相对的抵抗凋亡。与上调多种 ECM 成分的合成与降解不同，纤维消解通过
9、TIMP-1 的持续合成和纤维消解 MMPs 的产生减少进一步组成。其他细胞类型和不同的刺激物或持续活化纤维形成。另一方面，一旦这些刺激物消退且有抗纤维化药物的帮助，纤维化可以通过消解移除过剩 ECM 的方式逆转，通常由相同的细胞在纤维生成中扮演中心角色，像 HSC和巨噬细胞/枯否细胞。图 2 促纤维形成在活化的胆管细胞和肌成纤维母细胞之间交联。活化、增殖的胆管细胞（“小管反应”） 产纤维形成刺激因子静息的星状细胞受损的肝细胞活化的胆道细胞胶原合成淋巴细胞巨噬细胞肝细胞和胆道细胞招募胶原蓄积循环的纤维化细胞肌纤维母细胞活化增殖迁移凋亡肝门或血管成纤维细胞活化的胆道细胞肌纤维母细胞整合素Yury
10、Popov, Detlef Schuppan. Targeting liver fibrosis: Strategies fordevelopment and validation of antifibrotic therapies. Hepatology, 2009, 50(4): 1294-1306.4生许多纤维形成刺激因子作用于 HSC 及成纤维母细胞， 包括细胞因子 （TGFTGF） ， 生长因子 （PDGF-BB,CTGF），生物活性分子（ET-A）和存活/分化 因子（配位基，HhL）。活化的胆管细胞也表达整合素v6，整合素v6 可以联合和活化 TGF1，因此促使此处纤维化形成。在一
11、个活性的回馈机制中，活化的 HSC为胆管细胞产生生长和存活因子（HGF, Bfgf, IL-6, HhL），可以复制双重信息的胚胎机制进一步扩大纤维化反应。验证有潜力的抗纤维化的临床前模型验证有潜力的抗纤维化的临床前模型体外模型体外模型体外模型对加快我们对肝纤维化的分子病理学的理解是必要的4。它们也允许高流通量的检测和改善有潜力的抗纤维化药物，主要导致低花费并且高生产。但是，体外模型的有效性，如培养的活化 HSC 和为药物研发准备的 HSC 线都是有限的，因为它们没有反应出活体内纤维化或纤维溶解的复杂关联，如（1）其他细胞类型的贡献或关联；（2）许多由其他细胞产生的细胞因子、生长因子和其它介质
12、；（3）正常或改变的 ECM；和（4）血管结构、氧供应和活性氧产量的改变。培养的活培养的活化化HSHSHSHSC C C C和肝星状细胞线和肝星状细胞线 尽管活化的HSC毫无疑问是肝纤维化中过剩和异常的 ECM 的主要产生者，这些细胞在活体内是同源的，可能衍生于不同的先体，包括门或小静脉的成纤维细胞20，循环的肝细胞，7,21或上皮-间质转化途径（EMT）9,10。(图 1)当在培养基培养时，新鲜分离的小鼠或人类静息的 HSC 进行瞬间的纤维生成活化到肌纤维样母细胞。这种现象在研究 HSC 活化的基本机制和评价潜在的抗纤维化药物时被广泛应用4。但是，最近的研究表明应用此模型时需注意，因为在体内
13、和体外活化的 HSC 中找到的重要表型不同。 对比培养的活化 HSC 与从纤维化肝脏中新鲜分离的活化 HSC 的全球基因表达模式，发现仅有 56%-63%的覆盖率，当活化的 HSC 与库普弗细胞在一起培养时有一个更好的相近值22。已经产生和标记几个 HSC 线，如从 CCl4致纤维化小鼠肝脏中分离的瞬时存活 HSC 的克隆23，由 SV40T-抗体的人体 LX-1 和 LX-2HSC 存活24，或者 TWNT，一种由端区酶逆转录酶基因的病毒转化路径产生的人体 HSC 线25。尽管他们的限制性，这些细胞线是在早期药物发现中有用的而且有花费价值的工具。肝纤维化中的其他细胞类型的培养肝纤维化中的其他
14、细胞类型的培养 活化的胆管细胞在纤维形成中扮演着重要角色。16,17,26他们的抑制因子防止促纤维生长因子的过多释放，如 TGF1 ,TGF2 ,或 CTGF.活化的胆管细胞的细胞线已为检测抑制因子可用。17,27,28肝细胞、枯否细胞或不同的淋巴细胞亚型YuryPopov, Detlef Schuppan. Targeting liver fibrosis: Strategies fordevelopment and validation of antifibrotic therapies. Hepatology, 2009, 50(4): 1294-1306.5的培养是现在有限的利用， 因
15、为这些细胞能显示纤维产生或纤维溶解活性， 依赖于活化的背景和内容3,29。精确切取的组织培养片段精确切取的组织培养片段 新鲜准备的精确切取的肝脏片段能在体外维持肝细胞代谢功能至少 24 个小时，对毒理研究是有用的。最近，从正常和纤维化肝脏获取的培养片段建议作为学习纤维形成的工具30，对研究潜在的抗纤维化药物如pentoxiphylline 或络氨酸激酶抑制剂 Gleevec31都是可利用的。尽管标准化器官片段的产生不是不费力的，这种方法提供了多于传统细胞培养的优势。第一，片断可以直接由纤维化肝脏获得，可能包括由活化的HSC自然产生的光谱。第二，他们包含他们的自发性三面（3D）纤维化微环境中的肝
16、细胞（实质的和非实质的），可大量消除束体外培养人为产物，特别是关注导致非HSC靶点被忽视的效用。第三，在来自少数动物中的切片中，多样的药物可以观察到是有效地，是在应用大量的实验动物观察生长的伦理道德上的关切的很大进步。 第四， 这个系统允许平行研究这些实验药物的肝脏毒理。 但是， 更多的研究需要来验证日常抗纤维化药物筛选的器官片段培养模型。人工器官组织培养工程人工器官组织培养工程在微-和毫微技术已经取得重大进步，旨在通过生物工程在一个经精密控制的环境下修复正常或病变的肝组织结构。 小型化， 多轮的人肝脏细胞的培养系统，伴随最佳化的微量结构，可以在几周内研究维持肝细胞的表型功能。32这种先驱综合了物理学，工程学和生物学，已经改变传统的2D细胞培养实践为更物理化的3D模式，潜在地重建体外多细胞的肝环境。因此，最近报道一个应用肝细胞和3T3成纤维细胞的控制的3D共培养系统33。用来创建多肝细胞，HSC，上皮细胞，库普弗细胞和胆道细胞的多细胞人工培养的工程正在研究中， 提供了一个较高生产和有效花费的平台来发展和研究抗纤维化药物在近期的物理化研究的肝细胞微环境。表
