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1、嘌呤霉素筛选程序嘌呤霉素筛选程序一、一、杀伤曲线杀伤曲线1. 在 24 孔板内接种细胞,约 3x104/孔,共 11 孔,培养过夜培养过夜。2. 第二天,观察细胞密度为 20%-30%。稀释嘌呤霉素 (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g/ml)至培养基, 每孔加入 0.75ml 培养基。3. 每隔 2 天天观察细胞的存活情况(贴壁细胞飘起即为死亡,悬浮细胞,可以通过观察细胞的膜情况来判断,死亡细胞的细胞膜较为粗糙,有皱褶,没光泽,准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准) ,每隔 2 天更换 0.75ml 含相应浓度嘌呤霉素的培养基。4. 筛选 4-7 天天内使细
2、胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度,即为杀伤浓度(筛选浓度) ;二、二、细胞筛选细胞筛选1. 转染(24 孔板进行)或电转后培养 24 小时,按 10%密度传代(传至传至 35mm平皿平皿) ,继续培养 24 小时,待细胞密度增至 2025汇合时;2. 去掉培养液,PBS 洗一次,加入按最佳筛选浓度(杀伤曲线实验确定)配制好的嘌呤霉素筛选培养基 2-3ml。3. 根据培养基的颜色和细胞的存活情况,每隔 2 天更换一次筛选培养基 (培养培养基用量为基用量为 2-4ml,细胞多,多加培养基,细胞少,少加培养基,细胞多,多加培养基,细胞少,少加培养基), 一般在 3-4天内出现细胞大量或少量大量或少量死亡
3、情况(如果转染效率或电转效率高高,则死亡少少;如果转染效率或电转效率低低,则死亡多多;如果筛选浓度浓度偏低,筛选培养基用用量量少,细胞密度大于大于 80%,会导致大量假阳性克隆大量假阳性克隆) 。如果筛选第一周,出现细胞大量死亡,则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周;如果筛选第一周,出现细胞少量死亡,则把细胞按 10%密度传代(传至传至 35mm平皿,传一个皿即可,多余细胞丢弃平皿,传一个皿即可,多余细胞丢弃) ,利用筛选培养基进行筛选一周;4. 筛选第二周结束后,则把细胞消化下来,进行终点稀释(10ul 培养基中含 1个细胞,用筛选培养基) ,把上述 10ul 细胞悬液加入 96 孔板中(提前加入40ul 筛选培养基) ,一共加 24 孔,4 小时后观察每个孔的情况,记录只含一个细胞的孔,含有一个细胞的孔用于继续筛选,其余孔舍弃舍弃;5. 根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基,待细胞密度为 80%时,将其传代至 24 孔板中增殖,待细胞密度为 80%时,将其传代至 6 孔板中增殖,待细胞密度为 80%时,将其传代至 T25 瓶(一传 3)中增殖, 每隔每隔3 天换液天换液。6. 细胞大量扩增后,一瓶用于提取总 RNA 进行 QPCR 检测,一瓶用于总蛋白进行 WB 检测,另一瓶用于保种,根据 QPCR 和 WB 结果取舍阳性克隆;