嘌呤霉素筛选程序

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1、嘌呤霉素筛选程序嘌呤霉素筛选程序一、一、杀伤曲线杀伤曲线1. 在 24 孔板内接种细胞，约 3x104/孔，共 11 孔，培养过夜培养过夜。2. 第二天，观察细胞密度为 20%-30%。稀释嘌呤霉素 (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g/ml)至培养基, 每孔加入 0.75ml 培养基。3. 每隔 2 天天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准） ，每隔 2 天更换 0.75ml 含相应浓度嘌呤霉素的培养基。4. 筛选 4-7 天天内使细

2、胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度） ；二、二、细胞筛选细胞筛选1. 转染（24 孔板进行）或电转后培养 24 小时，按 10%密度传代（传至传至 35mm平皿平皿） ，继续培养 24 小时，待细胞密度增至 2025汇合时；2. 去掉培养液，PBS 洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制好的嘌呤霉素筛选培养基 2-3ml。3. 根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔 2 天更换一次筛选培养基 (培养培养基用量为基用量为 2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在 3-4天内出现细胞大量或少量大量或少量死亡

3、情况（如果转染效率或电转效率高高，则死亡少少；如果转染效率或电转效率低低，则死亡多多；如果筛选浓度浓度偏低，筛选培养基用用量量少，细胞密度大于大于 80%，会导致大量假阳性克隆大量假阳性克隆） 。如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按 10%密度传代（传至传至 35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃） ，利用筛选培养基进行筛选一周；4. 筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul 培养基中含 1个细胞，用筛选培养基） ，把上述 10ul 细胞悬液加入 96 孔板中（提前加入40ul 筛选培养基） ，一共加 24 孔，4 小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃舍弃；5. 根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为 80%时，将其传代至 24 孔板中增殖，待细胞密度为 80%时，将其传代至 6 孔板中增殖，待细胞密度为 80%时，将其传代至 T25 瓶（一传 3）中增殖, 每隔每隔3 天换液天换液。6. 细胞大量扩增后，一瓶用于提取总 RNA 进行 QPCR 检测，一瓶用于总蛋白进行 WB 检测，另一瓶用于保种，根据 QPCR 和 WB 结果取舍阳性克隆；