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1、 葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导 因子作者：吴海琴，张 蓓，张桂莲，展淑琴，张茹，赵英贤 【关键词】 血管性痴呆摘要：目的 观察葛根素对血管性痴呆(VD)大鼠海马中低氧诱 导因子 1 和红细胞生成素表达的影响并探讨其可能机制。方法 采 用大鼠双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)建立 VD 的动物模型，SD 大鼠随机分为假手术组、2VO 组和葛根素组，每组又分为 1 周、3 周、6 周、2 月(n=6)四个时间点；应用 Y 型水迷宫实验测定动物的 学习记忆能力，采用免疫组化法检测大鼠海马 CA1 区 HIF1 和 EPO 蛋白的表达。结果 2VO 组和葛根素组大鼠游全程时间和误入盲 端次数均
2、显著增加，但各时间点葛根素组大鼠的学习记忆成绩均显 著优于 2VO 组。各时间点，2VO 组和葛根素组大鼠海马 CA1 区 HIF1 和 EPO 的表达均较假手术组明显增高，但葛根素组两种蛋白 的表达均较 2VO 组明显降低。结论 葛根素可提高缺血脑组织细胞 内氧浓度，改善学习记忆功能，对 VD 具有确切的保护作用。关键词：葛根素；血管性痴呆；低氧诱导因子 1；促红细胞 生成素ABSTRACT: Objective To observe the effects of puerarin on the expression of hypoxia inducible factor1and eryth
3、ropoietin in the hippocampus of vascular dementia rats and to investigate its possible mechanisms. Methods Rats of experimental group were treated with a permanent bilateral common carotid arteries (CCA) occlusion (2VO) to establish vascular dementia model. Male SD rats were randomly divided into th
4、ree groups: shamoperated group, 2VO group and puerarin group(twentyfour rats in each group). Rats were evaluated on learningmemory ability by Ytype water maze test. At corresponding time points at 1w, 3w, 6w and 2mon, the dynamic expression of HIF1 and EPO in CA1 region of hippocampus was determined
5、 by immunohistochemical method. Results The swimming time and error times of rats in 2VO group and puerarin group were significantly increased; but at all time points the rats in puerarin group showed better performance than those in 2VO group. Both in 2VO group and puerarin group, the number of HIF
6、1 and EPO positive cells in hippocampal CA1 region were much more than that in shamoperated group; but the expression of HIF1 and EPO at each point in puerarin group was distinctly less than that in 2VO group. Conclusion Puerarin can increase the intracellular oxygen concentration and improve learni
7、ngmemory ability during cerebral ischemia, and it has definitely protective effects on VD.KEY WORDS: puerarin; vascular dementia; hypoxiainducible factor1; erythropoietin葛根素是从中药葛根中提取的主要有效成分之一，是一种异 黄酮类化合物，具有明确的扩张血管、改善微循环的作用，已被广 泛应用于心脑血管疾病的治疗。低氧诱导因子 1(hypoxia inducible factor1, HIF1)是低氧应答时诱导基因表达和恢复细胞内
8、环境稳定的 一个核心调节因子。红细胞生成素(erythropoietin, EPO)编码基因是 HIF1 下游 40 余种靶基因之一。葛根素对 HIF1 和 EPO 在血管性痴 呆(vascular dementia, VD)发生发展过程中表达的影响及其是否通过 HIF1/EPO 信号转导途径发挥对 VD 的保护作用尚未见报道。1 材料与方法1.1 动物分组 健康、雄性 SD(SpragueDawley)大鼠 72 只，体 重(28020)g，鼠龄 2-3 月(由西安交通大学医学院实验动物中心提供)。 经 Y 型水迷宫实验筛选后，随机平均分为三大组：假手术组、2VO 组和葛根素组，每组再根据缺
9、血时间血管分离暴露(阻断)至开胸灌 注的时间随机分为 4 个小组(每小组 6 只)：1 周组；3 周组； 6 周组；2 月组。1.2 主要试剂 葛根素注射液为陕西安康制药厂生产；HIF1 兔抗大鼠亲合纯化抗体来自武汉博士德生物工程有限公司；EPO 兔 抗大鼠单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司；SP 试剂盒、DAB 显色 试剂盒来自北京中山生物技术有限公司。1.3 模型的建立 VD 动物模型的制作参照 de la Torre 等采用 的双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)进行。0.67mol/L 水合氯醛 300mg/kg 腹腔注射麻醉，大鼠取颈前部正中切口，钝性分离双侧颈 总动脉(c
10、ommon carotid arteries, CCA)，套以 1 号手术线双重结扎， 逐层缝合。手术期间严密观察呼吸变化，保证有自主呼吸。假手术 组动物仅分离暴露双侧 CCA 而不结扎；葛根素组于术前 3d 至术后 1 周，每天给予葛根素注射液 100mg/kg 腹腔注射，手术当天于结扎 前 1h 给药；痴呆组于相同的时间分别给予等量 0.16mol/L 氯化钠溶 液腹腔注射。1.4 学习记忆的测定 应用 Y 型水迷宫实验进行大鼠学习记忆 能力的评估。Y 型水迷宫装置分为一个长臂(长 50cm)和两个短臂 (长 40cm)，各臂高 45cm，宽 30cm，长臂为起始区，其中一个短臂 为迷路区
11、(盲端)，上覆有不透明塑料板，形成暗道，另一短臂为安 全区，装有平台(30cm10cm)，上方有灯光照明。以大鼠自迷宫起 始区游至终点安全台所需时间和途中进入盲端的错误次数，作为衡 量学习、获得巩固记忆能力的指标。每只大鼠于测试当天共游迷宫10 次，测定学习成绩；24h 后重复上述过程测定记忆成绩。实验前 先行水迷宫实验，淘汰游泳能力差或智力低下(以游全程时间大于平 均成绩的 3 倍以上即 t25s 作为界点)的大鼠；术后 1 周、3 周、6 周、 2 月的各时间点的大鼠均于处死前再次行 Y 型水迷宫实验测定学习 记忆成绩。1.5 标本的采集 双侧 CCA 分离暴露(结扎)后 1 周、3 周、
12、6 周、2 月的各时间点，再次麻醉大鼠，开胸灌注，断头取脑，取前 囟后 3mm 至上丘平面间包含海马的脑组织块，1.39mol/L 多聚甲醛 固定、石蜡包埋。1.6 免疫组化染色(SP 法)及结果判定 将所取之脑块自前向后 行冠状切片，片厚 3m，梯度乙醇脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2 室温孵育 40min，微波抗原修复 10min，室温冷却 2h，正常血清封 闭 40min，分别滴加第一抗体(兔抗大鼠 HIF1 亲合纯化抗体，工作 浓度为 1200；兔抗大鼠 EPO 单克隆抗体，工作浓度为 1200)， 4过夜，生物素化二抗室温孵育 40min，加辣根过氧化物酶标记的 链酶卵白素工作液室
13、温孵育 30min，DAB 显色 5min，苏木素复染核， 脱水、透明、封片。TBS 缓冲液分别代替一抗经上述步骤染色作空 白对照。取假手术组、2VO 组和葛根素组各时间点两指标(HIF1 和 EPO)分别经 SP 染色所得的切片各 6 张，光学显微镜下观察大鼠海 马和大脑皮层的神经细胞，以胞质或胞核内出现鲜艳的棕黄色颗粒 的有核细胞为阳性细胞，每张切片高倍镜(1040 倍)下随机选择 5 个 不同的视野(均取自海马 CA1 区)，计数每个视野中 1mm1mm 面积 中阳性细胞数，取其平均值。1.7 统计学处理 实验数据用 SPSS 12. 0 统计软件进行分析， 所有数据以均值标准差表示，组
14、间比较采用方差分析和 t 检验法， 并应用 Correlate 进行相关性分析，取 P0.05 为显著性标准。2 结 果2.1 VD 模型制备情况 2VO 组死亡 4 只，葛根素组死亡 2 只 (1 只大鼠因术中损伤迷走神经迅速死于呼吸衰竭)，术后 24h 内，大 鼠出现四肢抽搐、翻滚、扭转痉挛后呼吸停止死亡，以上大鼠不列 入统计，另随机选取大鼠补齐；假手术组大鼠无死亡。结扎后发现 大多数大鼠眼睑下垂，起初兴奋不安，可有共济失调，随后肢体功 能活动逐渐恢复，无明显运动障碍，但自发活动减少，行动迟缓， 性格执拗。葛根素组大鼠上述变化较痴呆组明显改善。假手术组大 鼠较术前无明显变化。2VO 组和葛
15、根素每只大鼠断头取脑时均再次检查双侧 CCA 结扎 情况，若无丝线滑脱、松解(实验中发现所有大鼠双侧 CCA 均结扎 完好，造成了有效的脑缺血)，而且其学习记忆成绩相对于同时间点假手术组大鼠明显降低(P0.05)，则认为造模成功。2.2 学习记忆 能力检测 游全程所用时间越长，误入暗道的错误次数越多，说明其 学习记忆保持能力越差，提示学习记忆受损越重。缺血 1 周时，假 手术组、2VO 组和葛根素组三组大鼠的学习记忆成绩均无明显差异 (P0.05)；缺血 3 周、6 周、2 月时，与假手术组相比，2VO 组和 葛根素组的大鼠学习记忆成绩均明显下降(P0.05)，但葛根素组各 时间点学习记忆成绩
16、均较 2VO 组有明显提高(P0.05，表 1、表 2)。 表 1 不同实验组大鼠的学习成绩（略）表 2 不同实验组大鼠的记忆 成绩（略）2.3 HIF1 和 EPO 的表达 2VO 组和葛根素组各时间点、各大 鼠海马和大脑皮层均可见不同数量的 HIF1 表达，以缺血 1 周时最 明显，此后缓慢下降，但仍处于较高水平，主要是海马和皮层的锥 体细胞，血管内皮亦有明显 HIF1 阳性细胞分布，胞浆、胞核均有 明显着色(图 1、图 2)。EPO 亦于相应时间点明显表达于 2VO 组和 葛根素组大鼠的海马各区和大脑皮层，其蛋白表达随时间变化的规 律与 HIF1 大致相同(图 3)，而且在 2VO 组和葛根素组，HIF1 和 EPO 两蛋白的表达在 P0.01 水平上呈显著正相关 (r2VO=0.953，rPu=0.931)。除神经元外，EPO 还大量表达于星形胶 质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞，主要是胞浆表达(图 4)。假手术 组 HIF1 和 EPO 阳性细胞偶见
