《唐鱼三个分子伴侣基因的克隆及重金属对其mrna表达的影响推荐》由会员分享，可在线阅读，更多相关《唐鱼三个分子伴侣基因的克隆及重金属对其mrna表达的影响推荐（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、唐鱼三个熟休克蛋白全长c D N A s 的克隆及重金属( C u 和C d ) 暴露对其m R N A 表达的影响摘要本文以唐鱼( T a n i c h t h y sa l b o n u b e s ) 为研究对象，开展了其热休克蛋白( H e a ts h o c kp r o t e i n ，H S P ) 基因家族H S P 6 0 、H S P 7 0 以及H S P 9 0 三个成员的克隆，组织表达以及不同浓度的重金属( 铜和镉) 暴露下的表达等研究工作。结果如下：lH S P 6 0 、H S P 7 0 和H S P 9 0 基因c D N A 全长的克隆与分析采用同源
2、克隆和R A C E 技术分别克隆了这三个热休克蛋白基因e D N A 全长序列，T a H S P 6 0 ( G c n b a n k 登录号：H M 2 3 4 1 3 2 ) 序列全长2 4 8 6b p ，编码一个由5 7 5 个氨基酸残基组成的蛋白质，具有典型的m t H S P 6 0 特征序列，A T P 结合位点，以及C 末端保守的重复区域G G M 。T a H S P 7 0 ( G e n b a n k 登录号：H Q 0 0 7 3 5 2 ) 序列全长2 3 9 8b p ，编码一个由6 4 3 个氨基酸残基组成的蛋白质，具有3 个H S P 7 0 家族签名序
3、列( I D L G T T Y S 、I F D L G G G T F D V S I L 和V L V G G S T R I P K I Q K ) 以及C 末端胞质H S P 7 0特征基序E E V D 。T a H S P 9 0 ( G e n b a n k 登录号：H M 2 3 4 1 3 1 ) 序列全长2 6 8 6b p ，编码一个由7 2 6 个氨基酸残基组成的蛋白质，具有5 个高度保守的H S P 9 0 签名序列( N K E I F L R E L I S N A S A D A L D K I R 、L G T I A K R S G T 、I G Q F
4、 G V G F Y S A Y F L V A E D 1 、I K L Y V R R V F I 和G V V D S E D D L P L N I V S R E ) 以及C 末端胞质H S P 9 0 特有的基序M E E V D 。2H S P 6 0 、H S P 7 0 和H S P 9 0 的组织表达分析通过荧光定量P C R 技术检测了三个热休克蛋白基因在唐鱼成鱼肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道和脑中的表达情况。研究结果显示，H S P 6 0 基因m R N A 在肝脏中的表达量最高，其次是肌肉组织( 约为肝脏的O 6 7 倍，P 0 0 5 ) ，其它各组织与肝
5、脏相比均有显著差异( 氏0 0 5 ) ，其中眼睛中的H S P 7 0 表达量最低( 约为肝脏的O 3 8 倍) ，肠道、鳃、鳍条、卵巢和脑中H S P 7 0m R N A 的表达量分别为肝脏的0 6 0 倍、0 5 8 倍、O 4 9倍、0 4 2 倍和O 3 9 倍( 图2 4 ) 。7 52O8642OllOOOOOo崎厶_吉一-oIIoIsDIa】(oD召爵一星华中农业大学2 0 11 届硕士研究生学位论文LMGFE0lBT i s s u e s图2 - 4 荧光定量P C R 检测H S P 7 0 在不同组织中的转录水平F i g 2 4T h em e a s u r e
6、de x p r e s s i o nl e v e lo ft h eH S P 7 0t r a n s c r i p ti nd i f f e r e n tt i s s u e su s i n gq R T - P C R注：L ：肝脏，M ：肌肉，G 。鳃，F ：鳝条，E ：眼睛，o ：卵巢，l ：肠道，B ：脑N o t e ：V e r t i c a lb a r sr e p r e s e n tt h em e a nq - S D ( s t a n d a r dd e v i a t i o n ) ( N - t 2 ) L ：H v e r , M ：
7、m u s c l e , G ：g i I l ，F ：f i n ，E ：e y e ，o ：o v a r y , I ：i n t e s t i n e ，B ：b r a i n 2 5 唐鱼H S P 9 0 基因的组织特异性表达采用R e a l t i m eP C R 方法，以不同组织即肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道、脑等组织c D N A 为模板，根据唐鱼H S P 9 0 基因序列设计基因特异性引物，检测H S P 9 0 基因在各组织中的表达情况，结果发现不同组织的表达量存在明显差异，其中肝脏中的H S P 9 0 基因m R N A 表达量最高，肌肉组织和鳃
8、组织中m R N A 的表达平与肝脏相比没有显著差异( 尸 O 0 5 ) ，分别为肝脏的0 9 8 倍和0 8 5 倍，其它各组织与肝脏相比均有显著差异( 尸召矗一蛊华中农业大学2 0 11 届硕士研究生学位论文昱 名-o薹| 蠹 釜暑 器譬 o再岂LMGFEIBUT i s s u e s图2 6 争a c t i n 基因在不同组织中的相对表达量F i g 2 - 6R e l a t i v ee x p r e s s i o no fp a c t i ng e n ei n d i f f e r e n tt i s s u e s注：L ：肝脏，M ：肌肉，G ：鳃，F ：鳍
9、条，E ；眼睛，o ：卵巢，I ：肠道，B ；脑N o t e ：V e r t i c a lb a r sr e p r e s e n tt h em e a n4 - S D ( s t a n d a r dd e v i a t i o n ) 司2 ) L ：l i v e r , M ：m u s c l e ，G ：g i l l ，F ：i m ，E ：e y e , o ：o v a r y , l ：i n t e s t i n e ，B ：b r a i n 3 2 唐鱼热休克蛋白基因m R N A 组织表达差异迄今为止，广大研究者对热休克蛋白在生物体内不同组织或器
10、官中的表达进行了研究，但结果却各有不同。Z h o u 等( 2 0 1 0 ) 研究发现，南美白对虾( L i t o p e n a e u sv a n n a m e i ) 体内H S P 6 0 呈组成型表达，即在检测的血细胞、肌肉、肠道、心脏、肝胰腺和鳃中均有表达，且血细胞中表达量最高。万文菊等( 2 0 0 6 ) 研究表明剑尾鱼在正常情况下，其体内的H S P 7 0 基因在肝脏、心脏、肾脏和脾脏等组织中均不表达。在鲤体内，H S C 7 0 1 的表达呈现组织特异性，其在心脏、大脑和肌肉中均能检测到，而在肾脏和肝脏中均不能检测到该基因的表达；H S C 2 在大脑、肌肉、心
11、脏、肾脏和肝脏等组织中均能检测到表达，而鳍、肠道、性腺、粘液、鳃和鳔中均能检测到其表达( A l ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。林亚秋( 2 0 0 9 ) 通过R T - P C R 技术对鲤H S P 7 0 的组织表达情况进行研究，研究发现H S P 7 0 心脏、鳔、鳍、性腺和鳃中均有表达。“等( 2 0 0 9 )研究发现H S P 9 0 广泛分布于中国明虾( F e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s ) 的血细胞、鳃、肌肉、肠道、卵巢、头胸部以及肝胰腺等组织或器官中，其中卵巢中该基因的表达量最高。本文使用灵敏度相对较高的荧
12、光定量P C R 技术研究了H S P 6 0 、H S P 7 0 以及H S P 9 0 三个家族成员在唐鱼部分组织中的表达情况，结果发现在肝脏、肌肉、鳃、鳍条、眼睛、卵巢、肠道、脑等组织中均能检测到以上三个家族成员的表达，分布比较广泛。在所检测的组织中，T a H S P 6 0 在肝脏中表达量最高，肌肉和卵巢次之，而鳍条和鳃中呈微量表达。T a H S P 7 0 在肝脏中表达量最高，肌肉次之，其它各组织呈少量表达且均显著低于肝脏的表达水平。T a H S P 9 0 也是在肝脏中的表达量最高，lllOOOO唐色三个熟休克蛋白全长c D N A s 的克隆及重金属( C u 和C d
13、) 暴露对其m R N A 表达的影响肌肉和鳃次之，其余各组织的表达水平均显著低于肝脏，这一研究结果与前人报道的热休克蛋白广泛分布在动物各个细胞中的结论是一致的( H a r t la n dM a r t i n ，1 9 9 5 ) 。由于检测的组织中以肝脏的表达量最高，且最容易检出，故前人在研究中也多选取肝脏来检测不同条件下热休克蛋白的转录水平( 贾爱荣等，2 0 1 0 ) 。然而由于个体差异的存在，热休克蛋白基因在不同物种、不同条件、不同发育阶段的表达也有所不同( C h o we ta 1 ，2 0 0 9 ；Z h o ue ta 1 ，2 0 1 0 ) ，这就要求在今后的研究
14、工作中须对基因表达的时空性、不同条件下的表达调控作进一步的研究。华中农业大学2 0 11 届硕士研究生学位论文第三章重金属暴露对其m R N A 表达的影响近年来，由于重金属及其化合物的广泛使用，水生态系统中重金属污染已成为一个非常严峻的问题。水体中的重金属离子短期内不会对水生生物产生明显的影响，但当重金属离子不断的富集或超过一定的浓度之后，水生生物将会受到严重的影响。针对日益污染的环境状况，广大研究工作者选择了多个物种作为环境指示生物，且这些指示生物的生理生化指标( 如氧化酶活性、抗氧化酶活性、热休克蛋白等) 常作为生物标记物进行研究。生物标记物能够反映生物体的真实生理状态，且从生物体的细胞
15、或分子水平进行相关变化的监测。由于这种变化较生物体个体或群落结构上发生的变化要早，且较为灵敏，因此深受广大研究者关注。鱼类作为水生态系统的重要组成部分，不但分布广泛，而且其对重金属有一定的富集作用，因此，成为评价水体环境污染状况的理想生物。热休克蛋白是生物体内具有重要生物学功能的一类蛋白，是环境因子促使其基因表达的产物，该蛋白能够参与细胞内新生肽链的合成，提高生物体的耐受性( 吴厚雄，2 0 0 3 ；张建鑫等，2 0 0 8 ) 。正常情况下，在体内稳定表达，当有外界环境因子刺激时，生物体内的热休克蛋白会大量合成，从而保护生物体免受伤害。基于热休克蛋白广泛存在于从细菌到人类所有生物体内，且具
16、有高度保守性，大多数环境因子都能诱导其合成等特点( B i e r k e n se ta 1 ，2 0 0 0 ) ，热休克蛋白为分子生态学的研究开辟了新的思路。此外由于热休克蛋白在环境污染中具有重要的防御机制，尽管不具有特异性，但在生物体受应激反应持续的一段时间内，热休克蛋白会在体内积累，不但可以提高鱼类对于应激因子的耐受性，而且有助于了解生物体在这一胁迫下的“应激负荷“ 强度，因此，作为环境亚致死浓度污染首选的敏感性生物标志物已受到高度重视( 雷冬梅等，2 0 1 0 ) 。目前，关于重金属污染对鱼类应激反应的报道较多，但是主要是集中在热休克蛋白7 0 家族作为生物标志物方面，关于其它热休克蛋白家族的报道相对较少。1 材料与方法1 1 实验材料实验鱼为唐鱼( 7 7 a l b o n u b e s ) ，由珠江水产研究所提供，于华南环境研究所暂养，在3 0 0L 水族箱内暂养两周，每天投喂片状饲料两次，暂养期间活动正常，无病，死亡
