基因克隆技术在葡萄研究中的应用

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1、基因克隆技术在葡萄研究中的应用（西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100）摘摘 要要：本文从克隆工具及相关方案研究、基因克隆用于序列分析、葡萄生产相关基因的克隆与表达、用葡萄基因构建其它转基因生物、转基因技术面临的挑战与解决方案综述了基因克隆技术在葡萄研究中的应用，并并对相关问题进行了讨论和展望。关键词关键词：基因克隆；葡萄；应用The application of gene cloning in study of grapeSONG Chang-zheng(College of Enology, Northwest A F University, Yangling, Shaanxi

2、 712100, China)Abstract：we summarized the application of gene cloning in study of grape from the following points: tools of gene cloning and the optimizing of the study, the use of gene cloning in sequence analysis, cloning and expressing of the relevance genes in grape production, structure of othe

3、r organisms with genes from grape, challenge of transgenosis and solution. Furthermore we discussed related issues and had a look into the distance.Key words: gene cloning; grape; application引言葡萄是世界主栽果树之一，产量仅次于柑桔位居第二。世界年生产葡萄的80用来酿 酒，16鲜食，4制干(王华和张继澍. 2003)。多年来各葡萄生产国政府和科研工作者均 十分重视葡萄的生产和科研工作。 基因的克隆技术是生

4、命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内 容，它是随着20世纪70年代初DNA体外囊组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离 特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物 工程手段应用到生产实践(陈儒钢, 巩振辉等. 2009)。 目前基因克隆技术包括功能克隆，定位克隆，转座子标签法，抑制性差减杂交，同源 序列法，基因芯片，电子克隆等(陈儒钢, 巩振辉等. 2009)，每种克隆技术都有特有的功 能用途。随着生物技术的飞速发展，人们越来越多地把目光投向具有商业价值的转基因植 物。葡萄遗传中已有许多可以利用的目的基因，越来越多的目的基因已被克隆

5、测序分析， 或者导入葡萄中。同时，葡萄基因组中的一些基因也被作为目的基因转入其它生物（如酿 酒酵母及其他作物）中。1. 克隆工具及相关方案研究在常规的基因克隆过程中常见工具包括引入外源DNA的工具，稳定转基因DNA的工具， 选择标记，以及合适的启动子、终止子等(Schuller and Casal.2005)。 引入DNA的工具即载体，目前已经有一系列构建的穿梭载体用于促进目的基因在工程酵 母中的表达。被引入的载体必须具有在转化菌株中自我复制的能力并能传递给后代。目的 基因在重组菌株中可以通过载体的自我复制或者与宿主基因组整合而得到稳定(Schuller and Casal 2005; Fan

6、g, Salmon et al. 2011)。 通常是通过标记基因编码可以催化解毒的活性酶，或者是让菌株发生对抗生素不敏感 的突变,从而达到筛选重组菌株的功能。在将葡萄中的目的基因克隆转化到酿酒酵母的研究 也有很多，在构建工程酵母过程中的标记基因，包括隐性，半显性，显性标记(Cebollero, Gonzalez-Ramos et al. 2007)。隐性基因如URA3或者LEU2最为普遍。然而，因为酿酒酵母 菌株通常都是原养型的，这些标记基因都不能被使用。相比之下，显性或者半显性选择标 记的优点在于可以应用于任何菌株。例如，环己酰亚胺抗性基因，一个编码突变体核糖体 蛋白L29的半显性标记(P

7、rez-Gonzlez, Gonzlez et al. 1993)；使用更多的还有用于工 业酿酒酵母转基因的G418抗性基因(Wach, Brachat et al. 1994)。 在植物转基因过程中，通常两种标记基因也要引入：允许进行细胞筛选的选择基因和 可供观察转基因发生的报告基因。较多使用的选择基因有新霉素磷酸转移酶基因(nptII)， 对应抵抗卡那霉素；潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，抵抗潮霉素以及氨基转移酶，赋予除草 剂抗性。uidA编码的葡萄糖醛磷酸酶被广泛用作报告标记，但是有破坏分析成分的缺点。 因此，水母绿色 荧光蛋白成为了最受欢迎的可视化标记(Vidal, Gomez et

8、al. 2010)。 在大多数情况下，为了让目的基因尤其是异源基因在宿主体内较好地表达，强启动子 和强终止子会被使用到(Schuller and Casal 2005)。 在转基因葡萄构建过程中常用的介导转化的菌株是农杆菌，而在构建工程酿酒酵母中 常常使用穿梭质粒在大肠杆菌中扩增，或者直接转入酿酒酵母(Cebollero, Gonzalez- Ramos et al. 2007; Vidal, Gomez et al. 2010)。 转基因植株再生的过程：(i)初始培养，如胚胎发生组织；(ii)将目的基因转入细胞或 者细胞簇；(iii)选择性诱导类胚胎细胞结构；(iv)结构萌发成非嵌合的苗木(

9、Vidal, Gomez et al. 2010)。相关转基因方案的研究也比较多。 杨丽娜等以美人指葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnas 基因的受体, 对农杆 菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头抱霉素浓度等因素进行了 研究。 结果表明，最佳的农杆菌介导美人指葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min, 共培 养3 d,预培养3d,卡那霉素选择压3.0 mg/L, 头抱霉素质量浓度250 mg/L。采用此体系对美 人指葡萄进行转化,共获得12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%(杨丽娜, 刘 捷等. 2009)。 王彦立等以优良无核葡萄品种莫利莎葡萄试管苗

10、为试材,研究了卡那霉素(Kan)、潮霉 素(Hyg)对葡萄继代苗生长和离体叶片再生的影响.以确定叶盘法基因转化的选择压和转化 体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对葡萄离体叶片 再生的影响,以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度(王彦立, 贺柱等. 2009)。 李金凤等探讨了不同预培养时间、农杆菌侵染时间、共培养时间、卡那霉素选择压以 及头孢霉素抑菌浓度等因素对葡萄砧木5BB遗传转化的影响，以优化农杆菌介导法转化的遗 传转化体系，为葡萄砧木的转基因育种提供条件。试验中发现，随着侵染时间和共培养时 间的延长，葡萄砧木5BB不定芽再生率逐渐下降；但时

11、间过短，叶片的GUS瞬时表达率只有 20以下；葡萄组织对卡那霉素非常敏感，砧木5BB在3mg/L时已没有再生苗，与庄智敏等 的研究结果一致(李金凤, 杨丽娜等. 2009)。 Antonio-Jose等研究了鲜食葡萄品种绿宝石和克瑞森无核在低根癌农根菌浓度下高效 率遗传转化方案的开发。得到了高效率转化方案，并从低浓度根癌农根菌中的胚胎发生的 愈伤组织得到绿宝石和克瑞森无核转基因植物(Velasco, Pazos-Navarro et al. 2008)。2. 基因克隆用于序列分析宗成文等为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,

12、该序列与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法 克隆了LEAFY基因的5侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp。同 时发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区 别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性(宗成文, 章镇等. 2010)。 MADS-box转录因子在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的 作用。宗成文等为了从葡萄中克隆出新的MADS-box基因,研究在葡萄花及果实发育中的作用,根 据多种植物MADS-box基因保守区序列,应用RT-PCR技术从红富士葡萄花序

13、中分离出34条 MADS-box基因cDNA片段。这些片段长度在138152 bp之间,推导的氨基酸序列与已登录的 欧洲葡萄及其它物种的MADS-box基因同源性超过83%。用推导的氨基酸序列与已知的欧洲葡 萄和拟南芥MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分别归入拟南芥MADS- box基因不同亚家族中,证明葡萄中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型 中的各类花发育基因(宗成文, 房经贵等. 2007)。 李慧娥等于葡萄黑痘病发病盛期,用病叶压片法对高抗黑痘病的中国野生毛葡萄商- 24接种黑痘病病原菌,采用mRNA差异显示技术进行抗黑痘病基因表达差

14、异的研究.结果获得 了T11GG/B0304-400等9个基因表达差异cDNA片段；采用RACE技术克隆了T11GG/S438-353 mRNA片段的cDNA全长序列;序列分析表明,其编码氨基酸序列与拟南芥、欧洲葡萄、柳杉、 党参、无梗花栎、欧洲栗及寄生草钙调蛋白的一致性分别为99%、97%、94%、91%、90%、88%和 77%。表明该实验克隆到了负向调控中国野生毛葡萄抗黑痘病的钙调蛋白基因,并命名为 VqCaM,其GenBank登录号为EU694099;实时荧光定量PCR结果再次验证VqCaM表达受葡萄黑痘 病侵染下调(李慧娥,王西平等.2010)。 李小明等从葡萄中克隆白藜芦醇合酶基因

15、vrs1并对其序列进行生物信息学分析。测序 结果显示其cDNA序列全长为1 257bp,含有一个1 179bp的开放阅读框.生物信息学分析表明 葡萄白藜芦醇合酶基因编码392个氨基酸,分子量为42.9kDa,理论等电点为5.97,具有芪合酶 家族固保守结构域,二级结构主要由-螺旋、无规则卷曲、延伸链和-转角组成(李小明, 郭丽琼,等.2011)。 C. Verris等通过克隆及序列分析报到了嵌合基因AdhrVine-1，即将逆转录因子 Vine-1插入Adhr的基因。他们通过Adh基因组文库筛选出两个比一般Adh基因长的拷贝(3111 and 11111)，它们实际上是普通Adh基因插入了2.

16、39 kb的片段，命名为Adhr，插入的片段 命名为Vine-1。他们克隆并测序了Adhr基因的被内切酶NcoI分开的三个片段，并对Adhr的 结构，Vine-1的结构，Vine-1在不同葡萄属植物Adhr基因中插入，Vine-1相关序列在葡萄 属基因组中的分布进行了分析。得出以下结论：Vine-1是插入Adh gene家族的新成员Adhr 中的序列，该发现表明这个多基因家族可能还具有其他功能。Vine-1探针表明该元素可能 有助于酿酒葡萄的遗传变异，但不是无性系之间的变异性。对基因组中含有该元素的区域 的分子研究将有助于深度阐明它在葡萄属基因组演变与功能上的作用。Vine-1相关元素也 可能成为深度研究不同葡萄属以及不同葡萄栽培品种之间进化关系的分子工具(Verries, Bes et al. 2000)。 传统认为，鲜食葡萄红衣主教是由火焰蛤蜊葡萄和瑞必尔杂交获得。但是，A. Akkak 等通过DNA定型发现不是通过这种杂交得到的。具体过程是结合nSSR标记技术，通过克隆 VVS5微卫星位点等位基因片段将其连接在T载体