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1、分类号：R 5 5 13密级：学位类别：科学学位团专业学位口学校代码学号学科门类 又肄眚科矢垮 d 口a 卫耍正玛匹田E 匾歪面硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N论文题目：铁过载催化的氧化应激对间充质干细胞的影响及其作用机制TITL EE f f e c ta n dm e c h a n i s mo fi r o n - c a t a l y z e do x i d a t i v es t r e s so nm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s一级学科：临床医学二级学科：内科学血液病论文作者：卢
2、文艺指导教师：赵明峰导师组成员：李玉明邓琦天津医科大学研究生院二。一三年五月2 坼 = 酣学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：差垫日期：哆年j 月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编
3、以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密团。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者签名：导师签名：主翅。日期：) 。哆年j 月) - 日日期：j 。心戽j 月文1 3天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：探讨铁过载催化的氧化应激活性氧物质( R O S ) 生成对骨髓间充质干细胞( B M M S C ) 及脐带来源间充质干细胞( U C M S C ) 的细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、支持造血细胞集落形成能力的影响及其作用机制。方法：1 体外培养B M M S C 及U C M S C ，向培养液内加入枸
4、橼酸铁铵( F A G ) 建立体外铁过载模型，并通过检测细胞内不稳定铁池( L I P ) 的水平验证该模型是否成功。2 分别采用群体倍增时间( D T ) 检测铁过载B M M S C 、U C M S C 的细胞增殖能力，碘化丙啶( P I ) 染色方法检测细胞周期，A n n e x i nV P I 双标法检测细胞凋亡率，用共培养方法检测M S C 的造血支持能力。3 采用2 ，7 一二氯荧光黄双乙酸盐( D C F H o D A ) 探针法检测铁过载前后细胞内R O S 水平，并进一步通过W e s t e r nb l o t 检测R O S 相关信号因子磷酸化p 3 8丝裂原
5、活化蛋白激酶( P p 3 8 M A P K ) 、p 3 8 M A P K 、蛋白激酶B ( A K T ) 、p 5 3 蛋白的表达情况，并应用铁鳌合剂去铁胺( D F O ) ，抗氧化剂N 乙酰半胱氨酸( N A C )后检测相关蛋白表达的变化。结果：1 用贴壁法培养B M M S C ，三代后细胞形态均一一致，呈成纤维漩涡状贴壁生长，且纯度较高。当给予4 0 0 9 m o l LF A C 处理B M M S C2 4 h 后，加铁组B M - M S C 的L I P 水平明显高于对照组( P 0 0 5 ) ；加铁组U C - M S C 出现明显的G 0 G 1期阻滞，且其
6、凋亡率( 1 2 7 5 + 0 3 2 ) 明显高于对照组( 3 6 3 + 0 8 0 ) ( P O0 5 ，图9 ) 。通过A n n e x i nV - P I 斌染法检测发现，加铁组U C M S C 的凋亡率( 1 27 5 03 2 ) 明显高于对照组( 36 3 O8 0 ) ( P 00 5 ，图l O ) 。同时，通过细胞周期分析发现加铁组U C M S C 的G 2 M 及s 期的比例下降，出现G 0 G l 期细胞周期阻滞，而给于D F O 及N A C 处理后可相应恢复( 图1 1 ) 。同一细胞代数，与对照组比睾空，3 P 00 5 。经F A C 处理过的U
7、C M s c D T 明鼎延K ，但是加铁组与对照组在第5 代U C - M S C 中差异无统计学意义。 圈9 铁过载对U C M S C 增殖能力的影响U C M S Cc “ a k d w i t hF A Cs h o w e da n i n c r e a s eo f D t b u t t h e r e w e T en os i g n i f i c a md i f f e r e n c e i np a s s a g e5r P 00 5 ) V a l u e sr e p r e s e mm e a n S DF 1 9 9 T h ee f f e c
8、 to f i r o n o v “l o a d O n t h ep r o l i f e r a t i o no f U C M S C天津医科太学硕士学位论文= 、铁过载催化的活性氧生成对脐带间充质干细胞的作用“i i A 散点图B ：空白对照组；c ：对照组：D ：加铁组C 4 0 0 m o l L 浓度T 作月1 2 h )罔1 0 流式细胞术检测对照组与加铁组U C M S C 的凋亡水平AS c a t t e rd i a g r a m ；B B l a n kc o n t r o l ；Cc o n t r o l g r o u p ；Di r o no v
9、e r l d g r o u p ( a t t h ec o n c e n t r a t i o n o f 4 0 0 9 m o l L f o rI2 h 、F i 9 1 0 T h e e m to f c e l la p o p t c s i s i n i r o n o v 日l o a d g r o u pa n dc o n t r o lg r o u p e 篓寮7 “I 嚣1 ；= 。7 rL 璺毫L 一J 士k A ：对照组；B ：自f l 铁组C ：D F O 处理组；D ：N A C 处理组用4 0 0 1 a m o l L F A C 处理u
10、c M S C l 2 h 后，细胞出现G 0 G I 期细胞的比例明显升高，S 期细胞的数量明显槭少( B 1 。当在加铁处理后继续用1 0 0J j t m o l L D F 0 15 m m o l L N A C 处理细胞2 4 h后可部分恢复( c ，D ) 。 罔1 1 铁过载埘U C M S C 细胞周期的影响蓬一Ef ：_IJ1_，天津医科大学硕士学位论文、铁过载催化的活性氧生成对脐带问充质干细胞的作用A ：c o n f f d i g r o u p ；B ：i r o no v e r l o a d g r o u p ；C ：D F O g r o u p ；D ：
11、N A C g r o u pU C M S C w a s 自r e a t c d w i t h 4 0 0 p m o l L F A C f o r l 2 k t h a nc e l Ic y c l ea n a l y s i s w a s d o n ca f t e rP Is t a i n i n gF A C t r e a t m e n tr c _ s u h e d m l n c r e a s e d n u n t h e r o f c e l l s I n t h e G O ( 3 1p h a s eo f e e l Ic y c l e
12、a n dr e d u c e dn u m b e ro f c d l si nSp h a s eo f c e l lc y c l e ( F i g l 0B 1H o w e v e r , t r e a t i n g c e l l sw i t hl O O p m o l L D F O 5 m m o l L N A C f o r2 4 hr e d u c e d t h e p e r c e n t a g eo f U C - M S C l n G Oa n d l n c r e a s e dh a r c e n t a g e o f U C -
13、 M S C i nSp h a s c ( F i g l 0 C ，D )F i 9 1 1T h ee f f e c t o f l t o no v e r l o a d o n t h ec e l lc y c l eo f U C M S C223 铁过载对U C M S C 造血支持能力的影响在共培养1 周和2 倒时，加铁组U C M S C 支持脐血单个核细胞形成造血集落的能力明显低于对照组U C M S C ，且其中C F U G M 、B F U E 、C F U M i x 的数目与对照组相比差异有统讣学意义( P 00 5 ，见图1 2 ) 。雹 垂枞注：A ：共
14、培养体系培养一周后取出的悬浮细胞形成的造血集落数；B ：共培养体系培养二周后取出的悬浮细胞形成的造血集落数。C F U - G M ：粒单核系祖细胞集落形成单位：B F L L E ：爆式红系租细胞集落形成单位；C F U M i x ：混合系租细胞集落形成单位；t o t a l ：总的集落形 成单位。同一集落刺激因子。与对照组比较，忸0 0 5图1 2 铁过载对U C M S C 造血支持能力的影响U C M S Ce t r e a t e d w i t h 4 0 0 9 m o F LF A C f o r l 2 ht h e nc o - c u l t e d w i t h
15、 B M M N C f o r lw e e ka n d 2 w e e k s ( A a n d B ) ，t h ec o l o n y 岛r m i n gc a p a c i t y o f B M M N C w a s t h e ne v a l u a t e d b y C F Ca s s a yT h ec o l o n yf o r m i n gc a p a c i t yo f B M M N Cc o - c u l t u r e dw i t hU C - M S Ci ni r o no v e r l o a dg r o u pw a sd
16、 e c r 髓s e d i n d i c a t i n g t h e d e c r e a s e dh c m a t o p o i e t i c p r o g e n i t o rc e l l s i n B M M N C r P ( O0 5 )F i g l 2 T h ee f f e c t o f i r o no v e r l o a d o n t h e h e l l l a t o p d i e t i cs u p p o r t i v ec a p a c i t y o f U C - M S C224 铁过载U C M S C 内R O S 水平的变化加铁组细胞内的R O S 水平明显高于对照组，且R O S 的水平随着加铁浓度的增加而增加( P O0 5 ，图1 3 ) ，在4 0 0 ”m
