《脑缺血再灌注损伤皮层微血管超微结构及内皮细胞功能变化的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脑缺血再灌注损伤皮层微血管超微结构及内皮细胞功能变化的实验研究（63页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四军医大学硕士学位论文脑缺血再灌注损伤皮层微血管超微结构及内皮细胞功能变化的 实验研究姓名：马铁柱申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：李志超2003.5.1独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德本八声明所呈交的论文是找1 、八导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽找卢斤知除了文中特别朐标注和致谢的地方外论文中不色含其他八已经发表或撰写过的研究成果坦含本八或他八已申请学位或其他用途使用过的成果与找一同工作的同志本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致i 射申请学泣论文与资料若肓不实之处本八承担一切相关责任沦文l f 者蔓名：纽tF t 期：nc 厂，t
2、保护知识产权声明本八完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定即：研究生在校攻读键期间论文工作的知识产仪单位属第四军医大学本八保证毕业离校后发论文或使用论文工作成果时詈各单垃仍然为第四军医大学学校有权保留送论文的夏印件，允许论文被查闻和借同：学校可以公布论文的全部或部分内( 保密内容除9 ) ，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文、舣懈强喜2 率别。签名趁丝眦上蚍丛。- 军土t 曩士t 鲁文缩略词表B B BB l o o d - B r a i nB a r r i e r血脑屏障C B FC e r b r a lB l o o dF l o w脑血流C o P 0 2C o r t
3、i a lO x y g e nT e n s i o n 皮质氯分压E A AE x c i t i n gA m i n oA c i d兴奋氨基酸E CE n d o t h e l i a lC e l l内皮细臆H EH e m a t o x y l i n E o s i n 苏木I 婚红I - RI s c h e m i a - R e p e f f u s i o n 缺血再囊注M C AM i d d l eC e r e b r a lA r t e r y 大庸中动脉 M VM i c r o v i l l iI t 绒毛P A I - 1P l a s m i
4、n o g e nA c t i v a t o rI n h i b a t o r - 1纤涪原t 活物抑制物- 1P B SP h o s p h a t eB u f f e rS a l i n e 奠盐曩冲液P C DP r o g r a m m e dC e l lD e a t h纲赡程序性死亡P I DP e r i i n f a r c t i o nD e p o l a r i z a t i o n 梗死月曩去极化S DS p r a g u e - D a w l e yR a tS D 大鼠t - P AT i s s u eP l a s m i n o g
5、 e nA c t i v a t o r 组织纤涪酶焉激活物V E CV e s c u l a rE n d o t h e l i a lC e l l血瞥内皮细胞V W Fv o nW i l l e b r a n dF a c t o r园予相关抗原- 军土嘎士t t l 文摘要 f 脑缺血后的再灌注往往引起比缺血本身更为严重的损害。这是因为溶栓治疗血液循环再通后，引起微血管内皮细胞肿胀、坏死，同时内皮细胞功能失调，导致微血管结构、功能紊乱，破坏了血管结构的完整性，加重了脑血流供应障碍，进一步损害正常脑神经功能。所以研究脑缺血再灌注过程中微血管超锶瞄构特征和微血管内皮细胞结构、功能
6、变化与再灌注损伤的关系尤为重要。l 本实验采用三血管阻断法，利用大鼠全脑缺血3 0 m i n 再灌注模型检测再灌注后不同时间点血管完整性标记成份、内皮细胞促凝因子的表达变化和微血管超微结构的变化，试图阐明脑缺血再灌注损伤微血管内皮细胞结构、功能变化特点及微血管结构损害变化特征，为缺血性脑血管病的治疗提供依据和方法。本实验研究将健康雄性S D 大鼠随机分为缺血再灌注组和假手术组，采用三血管阻塞法建立大鼠全脑缺血再灌注模型，用免疫组化S A B C 法检测大鼠在全脑缺血3 0 m i n 再灌注l h 、3 h 、6 h 、1 2h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 时F 相关抗原的表达
7、，以标记微血管内皮细胞在脑缺血再灌注过程中损伤变化：同时用原位杂交法测定不同再灌注时间点P A I - 1 m R N A 的表达水平，以观察脑缺血再灌注后微血管内皮细胞纤溶活性的变化规律；同时利用多聚树脂预聚体灌注并选微血管铸型团行扫描电镜观察，探讨脑缺血再灌注后微血管变化特点。f 实验结果如下：1 微血管内皮细胞损伤实验结果：F 相关抗原主要在微血管内皮细胞表面表达，在缺血再灌注1 h 开始下降( P 0 0 5 ) 。2 、P A I - I m R N A 原位杂交试验结果：P A l - I m R N A 假手术组可见少量表达，脑缺血再灌注1 h 表达上调( 与假手术组相比P 0
8、0 5 ) 2 T h ee x p r e s s i o no fP A I - l m R N Ai ns i t uh y b r i d i z a t i o n ： P A I - l m R N AW a sd e t e c t e di ns h a mo p e r a t e dc o n t r o lg r o u pa n di n c r e a s e da tl ha f t e rc e r e b r a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o n ( P I I I 层。一般来说皮质内可见四层1 3- 军土叠嘎士量
9、t 论文血管网，第一层血管网位于分子层( I 层) ，又可分为表浅层( 无血管区)和深区两部，第二层位于锥体层的浅部( I I I a ，b ) ，第三层血管网位于皮质的中部( I I I c ，I V ，V a ) ，皮质的最大血管密度在此层；第四层位于皮质的深部( V b ，V I ) 。脑微血管在形态和结构方面具有特征性。从微血管系统结构上看，小动静脉的血管平滑肌层较之身体其他组织的血管为薄，其外侧缺乏纤维结缔组织的支持，其血管网的构筑形态赖以其相互间的分枝联系和脑胶质细胞的支持。皮层毛细血管从皮质内动脉发出后，相互联系，重重分枝，在同层次之间和不同层次之间构成了一种较为固定的网络性结构
10、。同时毛细血管是最细的连结成网的血管，管径一般为5 - 1 0 9 i n ，管壁由内皮细胞、基底膜及外围细胞突起构成。从微血管的立体形态即其分布、排列样式的构型看，脑微血管构型可归纳为树枝型，特点是微血管排列呈树枝状，管径较细，相互之间距离较大，这种构型主要是可以保证局部的物质交换，能满足脑部高代谢的特点。2 脑皮质血管的研究方法S c h a r r e r ( 1 9 4 0 年) 用明胶卡红填充静脉，用淀粉填充动脉，再与碘反应，使静脉呈红色，动脉呈蓝色。吴光明( 1 9 8 6 年) 则用银朱墨汁作动静脉连续灌注，使静脉呈黑色，动脉呈红色。钱桦( 1 9 8 9 年) 使用乙醚灌注，碱
11、性磷酸酶染色，镜下见静脉呈蓝色，动脉呈褐色。以后又有学者用D A B等染色，用透射电镜研究脑血管的超微结构。1 9 7 8 年，A a d e r s o n 首次把扫描电镜应用于脑微血管的研究，并根据内皮细胞核在管壁上的压迹来区分动静脉，动脉为卵圆形压迹，静脉为圆形深压迹，动脉管径较小，分支起点有明显的狭窄环，而静脉管径较大，行程上管径均一，其属支常以直角回流，汇入主干处可见三角形膨大。二、血脑屏障的结构功能及W U k 管内皮细臆的功能t1 4- 军土曩嘎士t t 静文1 血脑屏障的结构功能血脑屏障( B l o o d - B r a i nB a r r i e r , B B B )
12、 是指血液、脑组织之间和血液、脑脊液之间的屏障功能。屏障功能能够调节脑的代谢，维持神经元组织内环境的相对稳定。过去认为血脑屏障的解剖基础包括三层结构：脑血管内皮细胞、基底膜和星形细胞足突。而近1 0 年来，基于更多的电子显微镜和酶标记法的研究结果，目前普遍认为血脑屏障的组织学部位在毛细血管内皮细胞层，而脑毛细血管与普通毛细血管相比具有显著特点：内皮细胞间排列紧密，没有胞浆和胞浆内的窗。因此血脑屏障功能是否正常，是由毛细血管内皮细胞的化学、物理学特性决定的，内皮细胞在发生炎症，缺血、缺氧和肿瘤等病变时，均可出现血脑屏障异常。目前已证实脑缺血再灌注损伤重要的病理改变主要是血管通透性的改变和血管完整
13、性被破坏( T a f t ，1 9 8 7 年) 。2 微血管内皮细胞的功能血管内皮细胞( V a s c u l a rE n d o t h e l i a lC e l l ，V E C ) 作为构成B B B 的重要组成部分，除了起屏障功能外，尚具有多种功能：由于其分布广泛，受外界刺激时可表达和产生多种相关因子，在脑的炎症反应和免疫应答过程中有非常重要的作用( P o b e rS1 9 9 0 年，M o y e rC F1 9 9 1 年，S h i m i z uY1 9 9 2 年，Z h a n gR L1 9 9 5 年) ；脑缺血再灌注损伤时可刺激内皮细胞合成多种细胞因
14、子，这些细胞因子又可促进内皮细胞分泌粘附分子导致内皮细胞损伤( M o y e rC F1 9 9 1 ，Q 91 9 9 5 3 ：F V E 因子相关抗原( y o nW i l l e b r a n dF a c t o r ，v W F ) 是存在于血浆中的第因子的一种功能成分，v W F 是一种重要的内皮下粘附蛋白，绝大部分是血管内皮细胞合成、分泌的，仅在成熟的内皮细胞上存在，是目前公认的内皮细胞损伤标记物，它可以反映内皮细胞的功能状态( B l a m a , A D 等1 9 9 0 年，T s u d a h a r a 等，1 9 9 3 年) 。众所周知，无论血管壁、血流
15、状态或血液成分异常均可导致血栓形成的危险性增加。研究发现，血栓形成是血管内皮损伤后血小板聚集，纤维蛋白1 5- 丰太t 曩士曩t 静文 量曾曼皇曼曼曼曼曼曼量量曼曼曼曼曼罾目_ _ - _ 量曩_ _ _ - - 葺置l _ I - _ _ 寡寡甍舅喜篇鲁ii iI !酶激活与纤维蛋白形成等因素综合作用的结果。一旦内皮细胞受损，不仅暴露的内皮细胞下层可使血小板粘附聚集，导致血栓形成，而且受刺激的内皮细胞可释放组织因子，促进有凝血因子参与的外源性凝血过程，加速血栓形成。同时脑缺血损害是微循环水平降低而引起的微血管病变，伴随着脑缺血再灌注损伤还出现内皮细胞表面的抗凝促凝机制的变化。正常的内皮细胞具
16、有强大的抗凝功能，内皮细胞可以合成和释放一些与抗凝和促凝有关的因子：( 1 ) 前列腺环素( P G l 2 ) ：当内皮细胞受到凝血酶、缓激肽、干扰素、组胺以及硝酸甘油等刺激后，可以使细胞膜上的磷脂酶A 吐激活，使花生四烯酸从细胞膜磷脂中释放出来，通过环氧化酶的作用，产生前列腺素内过氧化物( P G G 2 、P ( 、H 2 ) ，后者通过内皮细胞内前列腺环素合成酶的作用转变为前列环素( P G l 2 ) 。P G l 2 具有明显的抑制血小板聚集和血管扩张作用，在调节血管壁局部的止血过程中具有重要的作用。( 2 ) 肝素与抗凝血酶复合物的作用：现已证实，在血管内壁腔面上有肝素存在，已从牛主动脉内膜和视网膜的微血管中分出肝素样分子，它是一种活泼的抗凝剂。这种肝素样分子能特异地与抗凝血酶结合，可增强抗凝的能力，从而使内皮层的抗凝血酶灭活I X a 和x a 速度加快。当血小板激活时可释入一种肝素酶，可使肝素降解增加，使抗凝血酶的活性降低
