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1、犬孕激素酶联免疫分析（犬孕激素酶联免疫分析（progestogenprogestogen） ELISAELISA试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究研究使用产品编号：E0697c预期应用预期应用 ELISA 法定量测定犬血清、血浆、或其它相关液体中孕激素含量。概述概述 孕激素主要由黄体产生，故又叫黄体酮。孕激素通常要在孕激素作用的基础上才能发 挥其作用。孕激素的主要作用，是促进子宫内膜特别是腺体的增长，为接纳受精卵做好准 备，如受精卵着床后，使胚胎继续发育。对子宫内膜癌及增生过度的内膜腺体，孕激素则 能使之萎缩退化。此外还能抑制子宫收缩，并减弱子宫对催产素的敏感性，使子宫活动减 少
2、，而起保胎作用。同时还与孕激素一起使乳腺发育，为产乳作好准备。 实验原理实验原理 本试剂盒应用竞争抑制酶标免疫分析法测定标本中孕激素水平。用纯化的抗体包被微 孔板，制成固相抗体，固相抗体与一定量的生物素标记的孕激素和非标记抗原(标本或标准 品)进行竞争抑制反应，待测定的标本量越多，抗体与生物素标记的孕激素结合就越少，反 之结合就多。最后再加入 HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在 过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品 中的孕激素呈负相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，计算样品浓度。 试剂盒组成试
3、剂盒组成 1 酶联板：一块（96 孔） 2 标准品：0.5ml/瓶6 瓶。其浓度依次为 100 ng/mL，20 ng /mL ，5 ng /mL，1 ng /mL 和 0.2 ng /mL，0 ng/mL。 3 检测溶液 A：16 ml 4 检测溶液 B：16 ml 5 底物溶液 A：17 ml 6 底物溶液 B：17 ml 7 浓洗涤液：1 15ml，使用时每瓶用蒸馏水稀释 20 倍。 8 终止液：17ml 标本的采集及保存标本的采集及保存 1血清：采集病人空腹血，标本请于室温放置 2 小时或 4过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20保存，但应避免
4、反复冻融。 2血浆：采集病人空腹血，可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8 C 1000 x g 离心 15 分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤操作步骤 各试剂在使用前平衡至室温。 1 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液标准溶液或待测样品 50ul。 2 每孔加入检测溶液检测溶液 A 50ul 及检测溶液检测溶液 B50ul，轻轻混匀，37，60 分钟。 3 洗板 3-5 次，3
5、50ul/每孔，甩干。 4 依序每孔加底物溶液底物溶液 A、B 各 50ul，37避光显色 15 分钟。 5 依序每孔加终止溶液终止溶液 50ul，终止反应。用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度 （OD 值） 。 注：注： 1 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及 2NH2SO4。测量时先用此孔调 OD 值至零。 2为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。洗板方法洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层 吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.4ml 注入孔内，浸泡 1-2
6、分 钟，根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的犬 T3，且与其它相关蛋白无交叉反应。检测范围：检测范围： 0.015 ng /mL -120 ng/mL计算计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标） ，OD 值为纵坐标（普通坐标） ，在半对数坐标 纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或 用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式， 计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项注意事项 1 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 2 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 3 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。 4 如标本中 T3 含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 5 底物请避光保存。 6温育反应过程中请帖粘胶板 7样品应尽早检测，贮存时间长，内含被检测物的活性将损失。说明说明 1试剂盒保存：-20（较长时间不用时） ；2-8（频繁使用时） 。 2有效期：6 个月 3浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 4中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
