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1、中山大学博士学位论文miR-21调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究姓名：李劲松申请学位级别：博士专业：口腔临床医学指导教师：黄洪章20080515中山大学博士学位论文m i R 21 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究m i R 一2 1 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究专业：口腔临床医学博士研究生：李劲松博士生导师：黄洪章教授中文摘要舌鳞状细胞癌( t o n g u es q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，T S C C ) 是最常见的口腔恶性肿瘤，约占口腔恶性肿瘤的4 3 4 。舌鳞状细胞癌常造成患者的语言、进食等功能障碍及颜面部的畸形，严重影响患者的生存质量
2、。舌鳞癌常常发生早期颈淋巴转移，且转移率较高。近二十年来，尽管临床上舌鳞癌的综合治疗已经很普遍，但以手术为丰，放化疗为辅的综合治疗对舌鳞癌生存率的提高并不明显，5 年总体生存率仍然较低，徘徊在5 0 5 5 左右，并没有显著提高，中晚期患者的5 年生存率更低，约为2 7 ，而且这些方法都存在各自的局限性，特别是对中晚期和复发患者疗效不佳，对伴有远处转移者疗效更差。因此，寻找更安全有效的治疗途径是提高舌鳞状细胞癌牛存率和生存质量所呕待解决的难题。大量的研究已经证实，人类疾病的发生发展直接和间接地与基因密切相关，因此，可以认为人类的疾病都是基因病。所以从本质上来说，舌鳞状细胞癌也是一种基因病，与细
3、胞的牛长增殖和凋亡失控等密切相关。从理论上讲，基因治疗有望解决这些问题，所以恶性肿瘤的基因治疗是近十几年来的研究热点。但长期以来人们一直不遗余力地寻找某一基因和某一疾病的对应关系，由于概念与技术的局限，把这种寻找变成了一对一的简单线性关系的研究，有“零敲碎打”之嫌，致使目前基因治疗的效果不尽人意。由于肿瘤的发生发展涉及多个编码基因的改一T 一中山大学博士学位论文m i R 2l 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究变，只是单纯抑制某个基因的表达，难以有效地起到抑癌作用。可喜的是，人类基因组计划已于2 0 0 3 年4 月完成全部序列测定，进入了后基因组时代即功能基因组学时代，基因组科学完成了一次历史性
4、转折，而疾病基因组学也不断取得成果，在观念和技术上，初步实现了由“零敲碎打”向“整体阐明”的转折。舌鳞癌细胞与其它恶性肿瘤一样，其生物学特性取决于其特异表达的基因，而在肿瘤发展过程中必然伴随着不同的基因表达变化。那么，调控舌鳞癌细胞特异的基因表达及其发展过程中基因表达变化的生物学机制是什么? 对于这一问题，虽然目前还没有确切的答案，但是，近年非编码R N A ( n o n - c o d i n gR N A s ) ，特别是微小分子R N A ( m i c r o R N A ，m i R N A ) 调控基因表达研究的兴起给回答该问题提供了新的线索。内源性m i R N A 可调控数十
5、到数百个基因的表达，因此，肿瘤细胞内起到“促癌”和“抑癌”作用的非编码m i R N A 比编码的癌基因和抑癌基因少得多，可以成为更稳定有效的抗癌靶点。m i R N A s 的研究分析提示，m i R N A s 参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、造血、器官形成、凋亡、细胞增殖，甚至是肿瘤发生。在众多相关疾病中，恶性肿瘤的m i R N A 表达异常最受瞩目。根据高通量的m i R N A 微阵列和实时定量R T - P C R ( q u a n t i t a t i v er e a l - t i m eP C R ，q R T - P C R ) 分析，发现在多种人类恶性肿
6、瘤中，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、淋巴瘤、白血病等的m i R N A表达谱与它们来源的正常组织存在很大区别，这种区别在低分化和恶性程度高的肿瘤组织表现得更显著些。在某些恶性肿瘤中，m i R N A 含量比来源的正常组织明显降低，肿瘤分化越差，m i R N A 的含量也越低，如在乳腺痛组织中，m i R - l O b 、l e t 一7 、m i R 一1 2 5 b 和m i R - 1 4 5 等的表达明显下调。而某些m i R N A 在肿瘤组织内的表达却有所上升，如乳腺癌中的m i R - 2 1 和m i R - 1 5 5 。恶性肿瘤m i R N A 表达的变化说
7、明肿瘤细胞基因调控机制发生改变，与c D N A 微阵列比较，m i R N A 表达谱能为癌肿的分子分期和分型提供更准确的信息。随着新的m i R N A 的不断发现及其功能的逐渐明确，使得m i R N A 的研究倍受关注，成为当前研究的热点之一。大量研究发现在癌细胞中表达异常的m i R N A 的靶基因属于癌基因或者抑癌基因，这些靶基因都与细胞的增殖、凋亡或分化密切相关。正是因为m i R N A 具有调节癌基因或者抑癌基因表达的功能，故其自身也充当着“抑癌基因”和“癌基因”的角色。然而在头颈肿瘤，特别是以舌鳞癌为代表中山大学博上学位论文m i R 2 1 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究
8、的口腔鳞状细胞癌中相关m i R N A 及其功能的研究未见报道。本研究采用高通量的m i R N A 微阵列筛选出不同分期的舌鳞癌组织和癌旁正常组织中差异表达的内源性m i R N A ，获得舌鳞癌细胞的m i R N A 表达谱；选取在早期和中晚期舌鳞癌中都显著高表达的m i R - 2 1 为进一步研究对象，通过q R T P C R 验证其在5 0 例不同分期舌鳞癌组织中的差异表达；同时采用免疫组织化学方法检测m i R - 2 1 靶基因原肌球蛋白l ( t r o p o m y o s i n l ，T P M 1 ) 在同样5 0 例舌鳞癌组织中的表达，并用T u n e l凋
9、亡检测试剂盒检测细胞凋亡，结合患者的临床资料统计分析相关指标之间的关系。在此基础上，建立体外培养舌鳞癌细胞模型，检测m i R 一2 1 在细胞中的表达，并通过转染m i R 一2 1 拮抗物和T P M - 1s i R N A 对其调控功能进行分析研究。为阐明m i R N A 调控舌鳞癌细胞增殖、分化和凋亡的生物学机制提供新线索，以期为研制靶向舌鳞癌细胞的m i R N A 或其靶基因的新型基因药物提供实验依据。第一部分舌鳞癌组织和癌旁正常组织m i R N A 差异表达分析目前研究m i R N A 表达的方法有克隆测序、R N A 印迹以及R N A 酶保护分析( R N A a s
10、 ep r o t e c t i o na s s a y ，R P A ) 。但对于肿瘤研究，非常需要大规模比较肿瘤组织和正常组织中的m i R N A s 表达谱差异，以上的方法耗时耗力，检测的通量不高。而基于荧光标记的基因芯片技术( M i c r o a r r a yt e c h n o l o g y ) 提供了大量检测多种m i R N A s 表达的平台。这一技术可以有效快捷地同时比较大量m i R N A s表达变化情况，己在诸多实验室被用于m i R N A s 的研究。R N A 印迹和R T P C R 技术虽然是低通量的检测技术，但芯片检测的结果仍需要它们进行验证
11、。检测成熟m i R N A 的P C R 方法是最近才发展起来的方法，它是验证m i R N A 芯片数据或检测单个m i R N A 表达的高灵敏度的方法。本部分研究应用m i R N A 微阵列技术，初步分析舌鳞癌组织和癌旁正常组织m i R N A 表达谱的差异和不同分期的舌鳞癌m i R N A 表达谱变化。选取在早期和中晚期舌鳞癌中都显著高表达的m i R - 2 1 为进一步研究对象，通过q R T P C R 验证其在5 0 例不同分期舌鳞癌组织中的差异表达。研究结果显示：1 舌鳞癌组织和癌旁正常舌黏膜组织中存在差异表达的m i R N A 分子。从总中山大学博士学位论文m i
12、 R 2 1 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究体上看，晚期舌鳞癌组m iR N A 分子表达差异较大，早期组差异相对较小。2 在早期舌鳞癌组中，与正常舌黏膜相比具有表达变化的m i R N A 分子有2 5个，其中上调表达的有1 0 个( m i R 一1 6 ，m i R 一2 1 ，m i R - 3 1 ，) ，下调表达的有1 5 个( m i R - 2 6 b ，m i R 一1 4 8 a ，m i R 一1 9 8 ，) 。3 在晚期舌鳞癌组中，与正常舌黏膜相比具有表达变化的m i R N A 分子有2 8个，其中上调表达的有2 6 个( m i R 一2 1 ，m i R 一1 2
13、 6 ，m i R - 5 1 3 ，) ，下调表达的有2 个( m i R - 2 3 a ，m i R 一2 6 a ) 。4 q R T P C R 检测验证显示舌鳞痛组织中m i R - 2 1 的表达高于癌旁组织，中晚期舌鳞癌组与早期组相比，m i R - 2 1 的表达倍数改变的差异有统计学意义( 尺0 0 0 1 ) 。在不同生存状态组中m i R - 2 1 表达倍数改变的差异有统计学意义( f ( O 0 0 1 ) 。第二部分m i R - 2 1 、T P M _ 1 和细胞凋亡的相互关系及临床意义一些实验和临床研究证据都显示，m i R N A s 可以作为一类新的肿瘤
14、癌基因或者肿瘤抑制基因。当这些m i R N A s 的表达在肿瘤中增高的时候，就被看作癌基因，它们通过促进肿瘤增殖或者抑制肿瘤抑制基因，调控肿瘤细胞的分化和凋亡。目前研究已经发现很多m i R N A s 在不同的肿瘤中过度表达，它们都作为原癌基因促进肿瘤增殖，但是只有其中少数部分的功能研究得比较清楚。有学者对多种肿瘤中都表达升高的m i R N A s 进行归纳，发现m i R 一2 1 在几种肿瘤中都是表达升高的。近年来，许多学者对T P M 一1 的组成结构及与多种肿瘤的关系进行了研究，普遍认为T P M - 1 作为一个抑癌基因有可能成为一种新的肿瘤标记物。国外的一项研究提示T P
15、M l 是m i R 一2 1 的一个靶基因，下调m i R - 2 1 可提高T P M - 1 的表达，促进乳腺癌细胞的凋亡。为了解m i R 一2 1 、T P M - 1 表达与舌鳞癌细胞凋亡的相关性，本实验采用免疫组织化学方法检测m i R - 2 1 靶基因T P M - 1 在同样5 0 例舌鳞癌组织中的表达，并用T u n e l 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡指数( a p o p t o s i si n d e x ，A I ) ，结合患者的临床资料统计分析相关指标之间的关系。研究结果显示：1 T P M - 1 在舌鳞癌组织中呈阴性或弱阳性表达，而在癌旁组织中呈现阳性一I
16、V 中山大学博士学位论文m i R 2 1 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究或强阳性表达，二者有显著性差异( P P 囊 鬻i 靛 骤 藩 导 、 C1 31 21 11 0L n ( 中晚期试验组一s V 0 1 )图卜2中晚期舌鳞癌组芯片上两样品的杂交信号相关性散点图一2 2 432lO9876一oAS。囊琵靛踩斗一口，I中山大学博上学位论文m i R 一2 1 调控舌鳞癌细胞凋亡的实验研究1 3m i R N A 芯片差异表达基因筛选结果本实验采用的m i R N A 探针文库购白I n v i t r o g e n 公司，另外包括部分根据文献报道和预测分析由深圳微芯生物科技公司设计合成的探针，所有探针长度在3 4 一- - 4 4 碱基K 度。共有1 1 5 2 个探针，包括重复点样的3 3 1 个人类来源的m i R N A分子、2 3 6 个小鼠来源的m i R N A 分子、1 8 9 个大鼠来源的m i R N A 分子、以及1 4 2个预测的m i R N A 分子，其他为各种阴性对照和外参照分子
