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1、三峡大学硕士学位论文青蒿琥酯抗小鼠宫颈癌的作用及机理的实验研究姓名：杜幼芹申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：肖长义20050401内 容 摘 要 目的：目的：研究青蒿琥酯的抗宫颈癌作用及其作用机制。 方法：方法：用青蒿琥酯在体外和体内进行抗肿瘤实验，用MTT法观察不同浓度的青蒿琥酯对体外培养U14 细胞的杀伤作用；建立小鼠宫颈癌实体瘤及腹水瘤模型，分别用青蒿琥酯 200（高剂量组） 、100（中剂量组） 、50（低剂量组）-1、顺铂 2 -1、（阳性对照组） 、青蒿琥酯 50 -1顺铂 1 -1、（联合用药组）对荷瘤鼠进行治疗 7 天，生理盐水组为阴性对照，观察药物对实体瘤的抑制作用，免
2、疫组化染色实体瘤组织，观察Bax、Bcl-2 基因的表达；观察用药后的腹水瘤各组体重变化情况及生存时间延长期，PI染色观察青蒿琥酯对腹水瘤中U14 细胞的细胞周期的影响。 结果结果：MTT体外实验表明青蒿琥酯对体外培养的U14 有抑制生长的作用，IC50 为62.77gml-1 ；青蒿琥酯对小鼠宫颈癌实体瘤有明显的抑制作用，其抑瘤率分别为52.59、44.44、31.84、61.45、51.85，免疫组化显示，青蒿琥酯组肿瘤标本中Bax蛋白阳性细胞数明显增多，Bcl-2 蛋白阳性细胞数明显减少。腹水瘤组结果显示， 青蒿琥酯能延长荷瘤鼠的生存天数， 生命延长率分别为： 76.7 （高剂量组） 、
3、45（中剂量组） 、31.7（低剂量组） 、100（阳性对照组） 、93.3%（联合用药组） ，PI染色显示各组均能使U14 腹水瘤S期细胞数明显减少，G1期的细胞数增加。 （所有结果采用方差分析） 结论：结论：青蒿琥酯对体外培养的小鼠宫颈癌细胞U14 有杀伤作用，体内实验结果显示青蒿琥酯对U14 实体瘤有抑制生长的作用，并能延长腹水瘤小鼠生存时间；其作用机制可能是通过诱导Bax基因的表达，抑制Bcl-2 基因的表达，诱导肿瘤细胞调亡，改变肿瘤细胞生长周期，将细胞生长阻滞在G1期。 关键词：青蒿琥酯 宫颈癌 免疫组化 细胞周期 关键词：青蒿琥酯 宫颈癌 免疫组化 细胞周期 IIAbstract
4、 Objective: To research the inhibitory effects and the mechanism of Artesunate on cervical cancer. Methods: We study the inhibitory effects of different concentrations artesunate on U14 in vitro through the method of MTT ; in our studies ,we construct the models of liquid tumor and solid tumor of mi
5、ce cervical cancer and treat the mice in different concentrations of artesunate: 200（high dose group） 、100（middle dose group） 、50（low dose group）-1,cisplatin (DDP)2 -1（positive group）,artesunate 50 -1 PPD1 -1（combination group） ,0.9%Nacl(negative group) for a week. The next day, we peel of the solid
6、 tumor, then stain the tissue of the solid tumor by immunohistochemistory staining and detect the expression of Bax and Bcl-2 gene; After the admistration of the Artesunate, we observe the changes of the weight and the time of survival about the mice in liquid tumor, on the other hand, observe the a
7、ffect of the artesunate on the U14 cell cycle through FCM by PI staining. Results: The experiment in vitro show that the artesunate has the ability to inhibit the growth of the U14 tumor cell by MTT method, IC50=62.77gml-1 ;The experiment in vivo show that artesunate can inhabit the growth of solid
8、tumor and liguid tumor, the anti-tumor rate of solid tumor was: 52.59,44.44,31.84,61.45,51.85. The results of immunohistochemistory staining show that expression of Bax genes increased significiently and the expression of Bcl-2 genes decreased; The life prolonger rate of liquid tumor mice was : 76.7
9、 （high dose group） , 45 （middle dose group） ,31.7 （low dose group） ,100 （positive group） ,93.3% （combination group） . The result of FCM show that artesunate reduced the tumor cells in stage S and increased the cells in stage G0G1. Conclusion: Our studies in vitro and in vivo suggest that Artesunate
10、has the ability to inhabit U14 tumor, the mechanism of ihabiting may be through upregulating the expression of Bax genes and downregulating the expression of Bcl-2 genes, then inducing the apoposis of tumor cell. On the other hand, it changes the cell cycle and blocks the cell cycle in stage G1. Key
11、 word: Artesunate cervical cancer immunohistochemistory cell cycle III三峡大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： I引 言 青蒿琥酯（artesunate ,Art） ，化学名为二氢青蒿素-1，2-琥珀酸单酯，是具有倍半萜内酯类抗疟新药青蒿
12、素(Artemisinin)的衍生物之一，青蒿琥酯作为全新结构的抗疟新药具有高效、速效、低毒、不易产生耐受等特点1。 1992 年中国科学院上海药物研究所邓定安2首先报道了青蒿酸衍生物对小鼠白血病P-388 细胞有杀伤活性,稍后合成了一系列具有不同抗癌活性的青蒿B衍生物,并发现除对P-388 细胞有活性外,对人肝癌细胞SMMC-7721 和人胃癌细胞SGC-7901 均有杀伤活性,但对正常人胚肺细胞WI-38 作用轻微,提示青蒿酸、青蒿B衍生物有选择性杀伤癌细胞的作用3。Efferth等通过研究青蒿琥酯酯对 55 种人体肿瘤细胞系的抗癌活性，结果显示,最敏感的为白血病及结肠癌细胞,中度敏感的有
13、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌,前列腺癌、中枢神经系统肿瘤及肾癌细胞等,非小细胞肺癌敏感性最差,鉴于青蒿素及其衍生物的确切抗癌作用,美国国家癌症研究所(national cancer institute ,NCI)已把其纳入抗癌药物筛选与抗癌活性研究计划4。 青蒿琥酯的抗肿瘤作用机制，目前尚不十分清楚 。在抗疟机制中，青蒿素及其衍生物青蒿琥酯的分子内含有内过氧化基团（Endoproxide） ，与亚铁原子起反应后产生自由基或亲电子中间产物，引起生物大分子的细胞损伤和细胞死亡，这是否是青蒿琥酯抗肿瘤的细胞毒作用机制，目前还存在争议，因为很多体外的抗肿瘤的细胞毒实验都是在无亚铁离子的情况下进行的，显示青
14、蒿素及其衍生物仍然抗肿瘤作用。具有Beekman等5提出,青蒿素对有增殖能力的干细胞的杀伤作用可能是由于其与细胞周期中某一特殊靶蛋白结合的结果，Efferth等用一组有某种特定基因突变的酵母菌做实验，发现有丝分裂调控基因BUB3 缺陷者对青蒿琥酯的敏感性增加，而有增值调控基因CLN2 缺陷的酵母菌对青蒿琥酯的抗性增加4。 青蒿素及其衍生物的抗肿瘤机制的关键可能是细胞周期的调控。张星等报道青蒿琥酯能诱导人肝癌细胞BEL-7402 发生凋亡，且是通过P53 非依赖途径诱导细胞凋亡的6，有哪些基因参与青蒿琥酯对肿瘤细胞诱导凋亡的调控，目前研究还不多。 体外实验表明青蒿素及其衍生物对多种动物和人体肿瘤
15、细胞有确切的抗癌作用，但体内抑制实验研究目前比较少，更谈不上临床研究。本实验通过建立小鼠宫颈癌腹水瘤和实体瘤模型，观察不同剂量的青蒿琥酯对腹水瘤和实体瘤的抑制作用，拟找到一个最佳治疗浓度，并通过用药后小鼠腹水瘤细胞周期的检测和实体瘤组织中Bax,Bcl-2 蛋白的表达的观察，探讨青蒿琥酯抗肿瘤作用的可能机制。 11 材料和方法材料和方法 1.1 主要仪器 (1) 流式细胞仪（美国 Beckman coulter 公司生产 EPICSXL-4 型） (2) 图像分析仪（德国莱卡仪器有限公司生产 LeicaQ500 型） (3) 酶联免疫检测仪（美国 BIO-RAD 公司生产 Model550 型
16、） (4) 高速冷冻离心机（Sigma 公司生产 3-18K 型） (5) -800C低温冰箱（美国LANIS公司生产） (6) 家用微波炉（Glanz-WD 900 ASL 23/2 型） (7) 低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂生产 LDZ5-2 型） (8) 台式高速离心机（法国 Hettich 公司-UNIVERSAL-16R 型） (9) 恒温水浴箱（上海跃进医疗仪器一厂生产 DZ-84 型） (10) 不锈钢正压过滤器（上海半岛净化器材厂生产-M-100mm 型） (11) 50ml，250ml 培养瓶（江苏玻璃仪器厂） (12) CO2培养箱（日本SANYO公司生产MCD175 型） (13) 倒置显微镜（重庆光学仪器厂生产 XSZ-D2 型） (14) 超净工作台（苏州
