白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的研究

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1、浙江大学硕士学位论文白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的研究姓名：童向民申请学位级别：硕士专业：内科学（血液病）指导教师：金洁2003.4.1浙江大学硕士学位论文白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的研究浙江大掌医掌院内科掌( 血液病)2 0 0 0 扳硕士研究生童向民导师金洁教授摘要树突状细胞( D e n d r i t i cc e l l ，D C ) 是目前功能最强，也是唯一可直接活化初始型T 细胞的抗原递呈细胞( A P C ) 。白血病细胞来源的树突状细胞，既携带肿瘤抗原，而且又是功能强大的A P C ，能激活细胞毒性T 淋巴细胞( C T L ) ，发挥自体抗白血病效应，为白血病的免

2、疫治疗开辟新的途径。本实验研究白血病细胞来源的树突状细胞形态、免疫标记、功能以及分泌I L 12 的能力。以2 4 例急性髓细胞白血病( A M L )和13 例慢性粒细胞自血病( C M L ) 的骨髓单个核细胞为研究对象，并以5 例健康献血员的外周血单个核细胞作为正常细胞，诱导扩增D C 。比较白血病来源的D C 与正常细胞来源的D C 在形态、免疫标记的表达和抗原递呈功能方面的差别。厂单个核细胞在细胞因子r h G M c s Fl o o n g m l 、r h I L 45 0 n g m l 和T N F a1 0 r i g。m l 的存在下，培养1 0 1 4 天作为实验组；

3、不加细胞因子培养相同时间作为对照组。用普通光学显微镜、倒置显微镜、透射屯镜观察到实验组的A M L 、C M L 细胞和正常单个核细胞在诱导分化过程中均可以聚集成簇，形成集落，边缘的细胞有毛刺状突出，最后可形成具有典型形态的D C 。5 例正常单个核细胞培养过程中均可以见到D C 的典型形态；而2 4 例A M L 细胞，1 9 例见到D C 的形态变化；l3 例C M L浙江大学硕士学位论文细胞1 1 例见到典型的D C 形态。对照组细胞生长缓慢，白血病细胞和正常细胞均没有出现D C 的形态变化。以流式细胞仪检测A M L 来源的D C 免疫标记C D 8 0 、C D 8 6 、C D 8

4、 3 、C D l 。、均较对照组明显提高，C D 8 0 ( 6 76 9 2 43 7 ) V S ( 1 95 9 I58 7 ) * , c r = 7 0 1 2 ，P = OO 0 0 1 )C D 8 6 ( 7 0 0 9 2 39 2 ) V S ( 2 53 4 1 50 4 ) ( T = 67 0 3 ，P = O0 0 0 1 ) ；C D 8 3( 6 58 22 5 0 6 ) V S( 2 07 3 154 7 ) ( T = 64 4 1P = O 0 0 0 1 ) ；C D I 。( 6 26 5 2 5 4 5 )V S ( 2 52 1 2 11 6

5、) ( T = 4 8 5 3 ，P = O 0 0 0 1 ) 。I - I L A - D R 有上升趋势，( 7 1 7 7 I80 9 )V S ( 5 43 2 3 89 3 ) ，但无统计学差异( T = I4 4 0 ，P = O17 ) 。C M L 来源的树突状细胞的免疫标记C D 8 0 、C D8 6 C D 。3 、C D l ，H L A D R 较对照组均明显提高。C D 8 0 ( 5 7 4 82 76 9 ) V S ( 188 3 1 98 7 ) ( T ；38 1 2 ，P = O 0 0 1 ) ；C D 。6( 6 17 3 2 85 4 ) V S

6、( 2 44 9 2 58 7 ) ( T = 3 2 6 7 ，P = O 0 0 3 7 ) ：C D 8 3( 5 1 9 2 3 41 2 ) V S ( 176 1 1 67 6 )( T = 30 7 7 ，P = 00 0 7 1 ) ；C D I ( 4 72 6 3 56 0 ) V S( 1 04 1 95 2 ) ( T ；34 8 2P 2 00 0 3 8 ) ；H L A D R ( 6 418 2 9 4 3 ) V S ( 1 25 3 1 16 9 ) ( T = 45 6 8 ，P = O0 0 12 ) 。而A M L - D C 与C M L - D C

7、 相互之间无差异( P O0 5 ) 。同样，正常细胞来源的树突状细胞的免疫标记C D 8 0 、C D 8 6 ，C D s 3 ，C D l 、I - I L A D R 均较对照组明显提高。C D 8 0 ( 6 04 51 40 4 ) V S ( 30 3 18 6 ) ( T = 81 0 5 ，P = O0 0 3 6 ) ；C D 。6( 8 47 5 1 60 9 ) V S( 89 0 84 9 ) ( T = 83 3 7 ，P = OO 0 0 2 ) ；C D 8 3( 7 06 3 1 27 2 ) V S ( 73 8 56 0 )( T = 90 5 7 ，P

8、= 00 0 0 3 ) ；C D l ( 6 8 8 5 1 23 1 ) V S( 87 5 5 8 3 ) ( T = 88 1 8P = 00 0 0 1 ) ：H L A - D R( 7 95 7 1 96 4 ) V S( 8 6 4 6 3 9 ) ( T = 68 6 7 ，P = O0 0 0 5 ) 。A M L D C 、C M L D C 与正常细胞来源的I ) C 免疫标记相比也无说明白血病来源的D C 与正常人的D C 免疫标记的表达相似。差异( P O0 5 )以荧光原位杂交法( F I S H ) 检测1 例A M L M 3 的P M L R A Rd 融合

9、基因，对照2浙江大学硕士学位论文组阳性率为8 0 ，具有D C 典型形态的实验组阳性率为8 3 。1 例C M L 的B C R A B L融合基因，对照组阳性率为7 5 ，具有D C 典型形态的实验组为7 0 。结合免疫标记的检测，可证实这类D C 是由白血病克隆的细胞分化而来。白细胞介素1 2 ( I L 12 ) 具有重要的免疫调节功能，可通过诱导I L 1 2 R 的B2链上调，促进T h l 细胞的分化，并可诱导C T L 细胞的产生，增强N K 细胞活性。成熟的D C 可以自分泌的形式分泌I L 1 2 。我们以E L I S A 法检测A M L 、C M L 实验组和对照组的I

10、 L 1 2 含量，发现A M L - D C 、C M L D C 均可以分泌I L 1 2 ，其分泌能力较对照组明显增强，A M L ( 2 8 7 2 28 5 ) p g m lv s ( 2 4 0 0 - - + 44 4 ) p g m l ( T = 36 2 3P = 00 0 1 1 ) ；C M L ( 2 7l3 25 6 ) p g m lV S ( 2 17 6 5 8 0 ) p g m l ( T = 27 8 6 ，P = 00 1 5 ) 。而A M L - D C 与C M L - D C 之间I L 1 2 的分泌能力相似( P 00 5 ) 。、丈M

11、T T 法检测混合淋巴细胞反应( M L R ) 中D C 刺激异体T 淋巴细胞增殖能力。随自血病来源的D C 、正常D C 与T 细胞比例上升( D C ：T = I ：1 0 0 ；l ：5 0 ：1 ：l O ；l ：1 ) ，其刺激T 淋巴细胞增殖的能力逐渐增强，且明显比对照组的细胞强。A M L 细胞D C ：T = l ：1 0 0 时，0l8 6 - + 00 4 4V S01 9 3 00 5 2 ( T = 06 2 0 ，p = 03 3 9 ) ；D C ：T = I ：5 0 时，02 8 6o0 7 6V S02 5 8 00 4 3 ( T = 20 0 9 , p

12、 = 00 5 9 ) ；D C ：T = 1 ：1 0 时。O4 5 3 0l3 9V S03 1 3 00 7 3 ( T = 55 6 7 ，p = 00 0 0 1 ) ；D C ：T = I ：l时，0 5 9 1O0 17V SO3 8 4 00 5 9 ( T = 73 1 2 , p = 00 0 0 1 ) 。C M L 细胞，D C ：T = l ：1 0 0 时，0 2 0 l 土0 0 5 7V S0 18 8 O0 4 3( T = 09 9 6 ，P = 0 3 2 3 ) ；D C ：T = I ：5 0 时，O 2 7 0 O0 7 3V S0 2 4 5 0

13、0 6 0 ( T = I 4 2 5 ，p = 0 1 6 9 ) ；D C ：T = 1 ：1 0 时，0 4 7 6 0 1 3 9V SO 3 1 6 O0 6 5 ( T = 5 6 6 5 , p = 00 0 0 1 ) ；D C ：T = I ：I 时，O6 5 801 9 8V S03 7 8 0 0 6 8 ( T = 7 3 3 2 , p = 0 0 0 0 1 ) 。正常细胞，D C ：T = I ：1 0 0 时，01 9 0 0 0 4 6V S015 9 00 2 9 ( T ；1 7 0 3 ，p = 01 0 8 ) ；D C ：T = l ：5 0 时，0

14、3 3 8 0 0 8 7V S0 2 3 2 3浙江大学硕士学位论文00 6 6 ( T = 29 17 ，p = 00 1 ) ；D C ：T = 1 ：10时，07 3 4 00 7 7V S03 2 6 00 6 9 ( T = 1 18 2 7 , p = 00 0 0 1 ) ；D CT = 1 ：1时，10 3 401 4 9V S04 0 500 8 7 ( T = 1 0 9 2 1 p = 00 0 0 1 ) 。A M L - D C 与C M L D C 相比无差异，但白血病来源的D C与正常D C 相比，其刺激T 细胞增殖的能力相对较低( P V S( 2 7 5 5

15、 8 3 ) ( T = 8 8 18 ，P = 0 0 0 0 1 ) ；H L A D R( 7 9 5 7 1 9 ，6 4 ) V S( 8 6 4 6 3 9 ) ( T = 6 8 6 7 ，P = 0 o 0 0 5 ) T h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nm o l e c u l e so nD C sc u l t u r e df r o mn o r m a l 。C M La n dA M LM N C sf o r10 - 14d a y si nt h

16、ep r e s e n c eo fc y t o k i n e s T oc o n f i r mt h el e u k e m i co r i g i no ft h ec u l t u r e dD C ，c y t o g e n e t i ca n a l y s i sw a sp e r f o r m e db yF l u o r e s c e n c ei n - s i t ua n do n eA M L M 3C a S eI nt h ec o n t r o lh y b r i d i z a t i o n ( F I S H ) f o ro n