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1、第二章 微生物工程菌种第一节 生产菌种来源第二节 发酵工业常用微生物第一节 生产菌种来源微生物工程工业生产水平的三个决定要素: 生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工 程工业生产的第一环节。一、菌种分离与筛选工作程序发酵工业上使用的微生物菌种，最初都是从自然界 中分离筛选出来的。分离与筛选菌种的具体做法一般分4个步骤：样品采集增殖培养纯种分离生产性能测定调查研究（包括资料查阅）试验方案设计采样第一次增殖培养第一次平板分离第二次增殖培养第二次平板分离增殖条件探索根据实际情况进 行定量或半定量 测定第一次原种斜面第二次原种斜面初筛（1株1瓶）定量或半定量测定
2、筛 选 工 作 程 序第三次平板分离第三次原种斜面复筛第四次平板分离不纯第四次原种斜面再复筛种子培养初步工艺条件摸索较优菌株1株3-5瓶保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验第三次菌种保藏二、分离与筛选的设计要求在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰 富的原料 2、菌的生长温度3、菌的稳定性4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6、容易从培养液中回收产物3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条， 便有希望成为效益高的生产菌株三、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目
3、的灵活掌握土壤（丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品 、海水、动物、植物、极端环境 根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样样品的预处理 目的：提高分离效率 方法： （表2-2含微生物材料的标本预处理方法） 物
4、理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法： 1%几丁质；碳酸钙 诱饵法： 石蜡；花粉；蛇皮；头发四、含微生物样品的富集培养富集(enrichment)培养 是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生 理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长 条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁 殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人 工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。这种 方法又被称为施加选择性压力分离法。 其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他 菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些抑 制剂。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物
5、分开；控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性（表2-4）如： 分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等选择性分离原理和技术 生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 选择性分离技术 富集液体培养技术 固体培养技术A.富集液体培养 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （max）筛选 ，存在选择压力的
6、控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ ）筛选 需注意，所需菌型生长的结果有时会改变培养基的 性质，从而改变选择压力。 重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培 养基上。 移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况 下进行。 ABS0基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（）的影响当SS0时，富集什么菌株？连续富集培养技术分离菌株的优点 分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物 B. 固体培养技术 常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质 五、利用固体平板的生化反应进行分离 利用特殊的
7、分离培养对大量混杂微生物进行初 步分离的方法。 分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性 或利用某些代谢产物生化反应来设计的。 可显著提高分离效率透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑菌圈法 1、透明圈法 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等； 在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面 ；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产 生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的
8、芽孢杆菌 分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明 圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据 ，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小 之间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的2、变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周 围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来。用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红 溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现 绛红色水解圈
9、。如： 筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈又如：分离解脂微生物豆油作底物中性红（红黄. 6.88.0. ）指 示菌落周围呈红色圈3、生长圈法 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和 维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进 行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌 落周围便会形成一个混浊的生长圈 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如：嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平 板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌 落即为嘌呤产生菌4、抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的分离筛选 工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某
10、些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈六、随机分离方法有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处 ，因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方 法并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。2）使用一聚合或复合形式的生长限制成分3）避免使用容易同化的碳（如葡萄糖）或氮（如NH4+ ），它们可能引起分解代谢阻遏。4）确定含有所需的辅因子（如Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+）5）加入缓冲液以减少pH变化七、一些生物活性物质产生菌的分离 抗生素抗肿瘤药物酶抑制剂生长因子等等1、抗生素产生
11、菌的分离抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）采用联合试验菌（枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭 状芽孢杆菌）分离到黄霉素采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活 剂等建立的筛选技术如棒酸（clavulanic acid）的发现：通过鉴定氨苄青霉 素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制 作用2、抗肿瘤药物产生菌的分离 临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法生
12、化诱导分析法（Biological induction analysis; BIA）是采用测定溶源性噬菌体阻遏物支配下的启动子控 制的转录和表达的酶活性的方法。即将E.coli lacZ 连接在噬菌体的PL启动子下当DNA损伤时，诱发阻遏蛋白CI分解， PL启动子启动 lacZ 基因转录，表达出-半乳糖苷酶。测定-半乳糖苷酶活性，可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的 存在。X-Gal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl -D- galactopyranoside; 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）作显色底物 ； 反应后呈蓝色3、酶抑制剂产生菌的分离 某些酶与病理相关 如
13、果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶靶 区 靶 酶抗高血压 血管紧张素转移酶抗糖尿病 -淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂症 缩合酶抗组氨 组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶4、生长因子产生菌的分离通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长， 来检测生长因子产生菌。分离培养基上培养被杀死的菌落周围有 无检测菌的生长圈影印到能支持生长因子产 生菌生长的培养基上Uv照射杀死菌落铺上一层含相应生 长因子缺陷型菌株第二节 发酵工业中常用微生物（一） 细菌1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 分布广，常存在于枯草、土壤等，一般 为腐
14、生菌；在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含 量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速 繁殖；不仅消耗原料蛋白质和淀粉，而且生 成刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制 曲失败。 能产生大量淀粉酶和蛋白酶AS1.393 蛋白酶 BF7658 -淀粉酶2、大肠杆菌(Escherichia coli) 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨 酸的定量分析 基因工程的很好材料3、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.) 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 可生产乳酸 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium a
15、cetobutyleum) 芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状 或鼓槌形 专性厌氧 发酵生产丙酮丁醇5、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) G+、微需氧至兼性厌氧，生长需要缬氨酸和谷氨酸 在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（2025C促使形成） 可生产葡聚糖 使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌6、醋酸菌 (Acetobacter) 不形成芽孢，G，好气性 分两群：1）只将乙醇氧化成醋酸 2）将产生的醋酸继续氧化成CO2和水 可生产醋酸7、棒状杆菌 (Corynebacterium) 以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸 的高产菌 生产谷氨酸等 如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.5428、短杆菌 (Brevibacterium)氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种， 也是酶法合成生产辅酶A的菌种9、黄单胞菌(Xanthomonas) 细胞直杆状，G，无芽孢，极生鞭毛 在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄 色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物荚膜多糖，其黄 色为一种水溶性色素 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以淀粉生产黄原胶 (Xanthan gum)10、假单胞菌(Pseudo
