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1、1第三章第三章 酶的发酵生产酶的发酵生产2l所有的生物体在一定条件下都能产生多种多样 的酶。l酶在生物体内产生的过程，称为酶的生物合成 。l经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞 的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称 为酶的发酵生产。3酶的来源酶的来源l分动物，植物，微生物。l用途分：工业用，分析用，药用。l工业用酶极大多数来源于微生物l微生物种类多,繁殖快,易培养,代谢能力强4l在酶的发酵生产中，第一位的是选育优 良的产酶细胞。l产酶细胞的要求：1.酶的产量高2.易培养和管理3.产酶的性能稳定4.利于酶产品的分离纯化5.安全可靠5l酶的发酵生产根据细胞培养方式的不同，可分为：l1.固体
2、培养发酵。l2.液体深层发酵l3.固定化细胞。l4.固定化原生质发酵。（酿酒，制曲-淀粉酶,蛋白酶; 设备简单,操作方便,尤其适用于霉菌的培养和发酵产酶, 但劳动强度大,原料利用率低.)（主要方式，应用广泛）。生产规模容易放大,原料利用率高, 但机械化程度要高,生产管理水平要求高67卧式旋转摇床立式旋转摇床8l固定化细胞发酵具有显著的优点：l1.固定化细胞的密度高，反应器水平生产强度较大， 可提高生产能力。l2.发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长的时间 ，易于连续化生产和自动化生产。l3.细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情 况下连续发酵，大大提高设备的利用率。l4.发酵液中含菌较
3、少，利于分离纯化，提高产品的质 量。载体：泡 沫塑料细胞：菌 丝 固定化 细胞9l固定化原生质发酵产酶：l针对于胞内酶的生产，80年代中期发展起固定化原生质 技术。原生质是指除去细胞壁的微生物细胞或植物细胞 。l固定化原生质技术特点如下：1.由于去除了细胞壁，可使胞内酶等胞内物质不断地分 泌到胞外。2.固定化原生质体有较好的稳定性，可反复或连续使用 相当长的时间。然而固定化原生质体的制备复杂，发酵液中需要维持较高 的渗透压，而且还要防止细胞壁的再生。102.1 2.1 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论112.1.1 2.1.1 酶生物合成的调节酶生物合成的调节l转录水平的调节,转录产物
4、的加工调节、 翻译水平的调节、翻译产物的加工调节 和酶降解的调节。l研究表明，至少在原核生物中，甚至在 所有生物中，转录水平的调节控制对酶 的生物合成是至关重要的。转录水平的调节控制，又称为基因的调节控制。12操纵子学说操纵子学说(Operon theory)(Operon theory) l基因调节控制理论在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有4种，即 调节基因（Regulator gene)、启动基因(Promoter gene)、操纵基 因(Operator gene)、结构基因(Structural gene)。结构基因的遗传信息通过mRNA，可翻译合成特定的酶。启动基因决定
5、酶的基因能否开始。由两个位点组成，一个是 RNA聚合酶的结合位点，一个是环腺苷酸（Cylic AMP) 与 CAP组成的复合物的结合位点（cAMP-CAP）调节基因可以产生由多个亚基组成的变构蛋白，这些蛋白能 和操纵基因结合,而且某些小分子效应物也能与这些蛋白结合 并改变其与操纵基因结合力的大小.操纵基因可以特异性的与调节基因产生的变构蛋白中的一种 结构结合，这种结合一旦形成，由于空间阻碍RNA聚合酶就 无法结合到启动基因的结合位点，就不能启动结构基因的转 录。13基因对酶生物合成的调节控制有3种方式l分解代谢阻遏作用l酶合成的诱导作用l酶合成的反阻遏作用。14l1. 分解代谢物阻遏作用：指容
6、易利用的 碳源阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物 合成的现象。葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶的合成；果糖阻遏 -淀粉酶的合成；控制好碳源的量葡萄糖效应：E. coli培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该 菌可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就 产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现 象”(diauxie或biphasic growth)，这一现象又称，产生的原因为葡 萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成。 15葡萄糖 效应分解代谢物阻 遏作用cAMP + H2O AMPATP葡萄糖分解能量腺苷酸环化酶葡萄糖降解物葡萄糖阻遏-半乳糖 苷酶的合成RPORS2S3S1DNA转
7、录mRNA 翻译E半乳糖苷酶透过酶转乙酰基酶CAMP-CAPRNA聚 合酶原因：调节基因启动基因 结构基因操纵基因162. 酶生物合成的诱导作用：加入某种物质，使酶的生物合 成开始或加速进行的过程。简称诱导作用，起诱导作用 的物质称为诱导剂。淀粉酶，蔗糖酶、尿酶的典 型的诱导物是：淀粉，蔗糖 和尿素。加入诱导物前，菌 生长，但不生产酶，加入诱 导物后酶的合成开始，当诱 导物除去时，合成即停止。lA-无诱导物时 B- 添加诱导物时酶生物合成的诱导作用17l诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类 似物，例如-半乳糖苷酶的作用底物乳糖及 其底物类似物IPTG可诱导-半乳糖苷酶的合 成l也可能是酶催化
8、反应的产物，半乳糖醛酸能 诱导果胶酶合成，而半乳糖醛酸是由果胶酶 催化果胶水解产生。l不同的酶由不同的诱导物产生。18l3. 酶生物合成的反馈阻遏作用：又称为产物阻遏作用 ，指的是酶催化产物或代谢途径的末端产物使该酶的 生物合成受阻的过程。引起反馈阻遏的物质称为共阻 遏物。色氨酸的合成：高浓 度色氨酸抑制合成色 氨酸所需酶的合成， 这就是典型的反馈阻 遏作用l酶生物合成的反馈阻遏作用（阻遏型操纵子） 192.2 2.2 酶发酵生产常用的微生物酶发酵生产常用的微生物l微生物发酵是酶的最主要来源经济。 发酵周期短，培养基廉价，适宜大规模生产筛选简单。 筛选程序简单，可在短时间内检测成千株培养物。产
9、酶的菌种多样。 催化同一反应的酶可从不同的菌种得到，选择余地大 ，便于选择适应反应器所需操作条件的菌 株20常用的产酶微生物常用的产酶微生物l一、细菌l具有重要应用价值l原核生物l产酶繁多：淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶等 多种21l1. 枯草芽孢杆菌：应 用最广泛的产酶细胞 ，可用于-淀粉酶 ，蛋白酶, -葡聚 糖酶，纤维磷酸酶的 生产。l2.大肠杆菌：可生产 多种酶（谷氨酸脱羧酶 ，天冬酰胺酶），但一 般为胞内酶，提取酶需 要细胞破碎。Escherichia coli 22l黑曲霉：可生产多种酶（淀粉酶，果胶酶，过氧 化氢酶），有胞内酶和胞外酶。l米曲霉：可生产糖化酶和蛋白酶(酿酒和制曲)。l青霉
10、：用于多种酶的生产。Penicillium 二、霉菌（丝状真菌）23l6. 木霉：生产纤维素酶的主要菌株。l7.根霉：具有较强的11- 羟化酶，是用 于甾体转化的主要菌株。l8.毛霉：用于蛋白酶，糖化酶， -淀粉 酶，脂肪酶的生产。l9.24三、放线菌三、放线菌l链霉菌：生产葡萄糖异构酶的主要菌株 。此外还含有丰富的16 羟化酶，可用 于甾体转化。25四、酵母四、酵母l啤酒酵母：主要用于酿造啤酒。l假丝酵母：单细胞蛋白的主要生产菌； 具有烷类代谢的酶系，可用于石油发酵 ；具有较强的17羟基化酶，可用于甾体 转化制造睾丸素。yeasts工业规模应用的微生物酶和来源纤维素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生
11、产，饲料添加剂， 消化植物细胞壁半纤维素 酶木霉、曲霉、根霉饲料添加剂，消化植物细胞 壁，低聚木糖生产葡聚糖酶枯草芽胞杆菌，黑曲 霉，Penicillium emersonii啤酒酿造，饲料添加剂异淀粉酶产气克雷伯氏菌， 芽孢杆菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母，米曲霉， 黑曲霉，米根霉乳品工业（处理牛乳和乳清）果胶酶曲霉、欧文氏菌水果加工，果汁、果酒澄清， 麻类纤维 脱胶工业规模应用的微生物酶和来源转化酶啤酒酵母、假丝酵母制造转化糖凝乳酶米赫毛霉,大肠杆菌和真 菌生产的重组酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗涤剂，油脂加工，生 物化工 葡萄糖氧化 酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖，测定 葡萄糖 葡萄
12、糖异构 酶凝结芽胞杆菌，白色链 霉菌生产果葡糖浆青霉素酰 化酶细菌、霉菌、放线菌制造6-氨基青霉烷酸282.3 2.3 发酵工艺条件及控制发酵工艺条件及控制保藏细胞细胞活化原生质体细胞扩大培养固定化细胞预培养无菌空气（溶解氧控制）发 酵固定化原生质体培养基 分离纯化酶温度控制pH控制29l一. 细胞活化与扩大培养l二. 培养基的配制培养基是指人工配制的用于细胞培养 和发酵的各种营养物质的混合物。培养基有多种多样，但基本组成包括 碳源、氮源、无机盐、水分和生长因素 等几方面。 30l1.碳源：指能够向细胞提供碳元素化合物的营养物质， 同时也是提供能量的能源。碳是构成细胞成分的主要元素 之一，也是
13、各种酶的主要组成元素，也是多种诱导酶的诱导物。l必须考虑原料的供求和价格问题l有无阻遏目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如 糊精、麦芽糖、葡萄糖等。31不同微生物要求的碳源不同，是由菌种自身的酶系（组成 酶或诱导酶）所决定。 葡萄糖、蔗糖等易利用的碳水化合物，对促进细胞的呼吸与 生长有利。高浓度下，对产酶有抑制作用，如蛋白酶和-淀粉 酶等.。 有些微生物不能利用复杂的碳水化合物，必须使用葡萄糖 等简单的碳水化合物时，可采用“流加法”等避免出现“葡萄 糖效应”现象；外加CAMP. 有时近似的碳源，也会因某些原因，出现不同的产酶情况，如 黄青霉（葡萄糖氧化酶产生菌）在甜菜糖蜜作碳源
14、时不产酶， 以甘蔗糖蜜作碳源时产酶量显著增高。 有些碳源本身就是酶的诱导物，如短乳杆菌（葡萄糖异构酶产 生菌）必须在木糖培养基上产酶，以葡萄糖作碳源时，尽管菌 体繁殖旺盛却不产酶。322.2.氮源：氮源：l是组成细胞蛋白质和核酸的主要元素之一，也是酶 分子的主要组成元素。凡是能够向细胞提供氮元素 的营养物质称为氮源。l有机氮源，无机氮源(可能引起pH变化)。l常见的氮源氮源的不同，也能起到诱导和阻遏酶形成的作用。在蛋白酶生 产中，蛋白质能诱导酶的形成，而它的水解物就不及它本身好。 氨基酸的作用变化很大，有的有利，有的抑制。33注意要维持合适的碳氮比（培养基中碳元素和氮元素之比）， 这点对产酶很
15、关键。 无机氮与有机氮的浓度比例、无机氮的种 类等。 在曲霉淀粉酶的生产过程中，如果碳源不足，不能得到充分的 能源，菌丝体对于氮源的消耗显著降低，影响淀粉酶的合成。 枯草杆菌产生果聚糖蔗糖酶时，培养基中蔗糖浓度10%，铵盐 如(NH4)SO4浓度必须超过菌体生长的最高需要量（即达到含氮 量0.15%左右），酶的产量才大幅度上升。 34l3. 无机盐：主要作用是提供细胞生命活动不 可缺少的无机元素，并对培养基的pH值，氧化 还原电位和渗透压起调节作用。有些金属离子本身就是酶的组成部分。盐对产酶的效应比 较复杂： 磷：多数情况对产酶有促进作用，在蛋白酶中比较明显 ； 钙：Ca2+对蛋白酶有明显的保
16、护和稳定作用。如无Ca2+ 存在时，灰色链霉菌中性蛋白酶只在pH77.5很狭范围内稳 定，当有Ca2+存在时，稳定pH范围扩大到59，35三三. . 发酵发酵pHpHl不同细胞生长繁殖的最适pH有所不同，一般细 菌和放线菌的生长最适pH值为中性和微碱性（ pH6.58.0）。l霉菌和酵母的生长最适pH为偏酸性（pH4.0 6.0）。l植物细胞生长的最适pH为56。36l细胞发酵产酶的最适pH通常接近该酶反应的pH值 。l有些细胞能产生多种酶，通过控制培养基的pH值 ，往往可以改变各种酶之间的产量比例。l黑曲霉可以生产-淀粉酶，也可生产糖化酶，pH 中性范围内，淀粉酶产量低而糖化酶高，酸性时， 相反。l培养基的pH值在细胞生长繁殖和代谢物产生的 过程中往往会发生变化。这种变化与细胞特性 有关，也与培养基的组分密切相关。37四四. . 温度的调节控制温度的调节控制l不同细胞有各自不同的最适生长温度。l枯草杆菌的最适生长温度3437l
