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1、1PCR技术2PCRPCR（ （Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction)技技术术即聚合即聚合酶酶链链反反应应，又称，又称DNADNA体外体外扩扩增技增技术术。 。19851985年由美国年由美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等等人人发发明的一种具有划明的一种具有划时时代意代意义义的分子生物的分子生物学技学技术术，被誉，被誉为为无无细细胞分子克隆胞分子克隆。 。3一、一、PCRPCR技技术术术术的的创创创创建建Khorana(1971) Khorana(1971)等提出在体外等提出在体外经经DN
2、ADNA变变性性, ,与适当引物与适当引物杂杂交交, ,再用再用DNADNA聚合聚合酶酶延伸延伸, ,克隆克隆DNADNA的的设设想。想。 19851985年年,Mullis,Mullis发发明了明了PCRPCR技技术术, ,使使KhoranaKhorana的的设设想得到想得到实实现现。 。19881988年年SaikiSaiki等将耐等将耐热热DNADNA聚合聚合酶酶（ （TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技技术术 1989 1989年美国年美国 ScienceScience 杂杂志列志列PCR PCR 为为十余十余项项重大科学重大科学发发明之首明之首, ,比比喻喻19891989年年
3、为为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣荣获获19931993年度年度诺贝诺贝尔尔化学化学奖奖。 。4三篇重要论文 The Unusual Origin of the Polymerase Chain The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 )64-5 ) Primer-directed Enzymatic Amplific
4、ation of DNA Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91(Science,1988,239(4839):487-91 ) ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Ch
5、ain Reaction (Methods in Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 )Enzymology, 1987,155:335-50 )5引物引物1983年 MullisMullis的构思的构思DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶特定特定DNADNA片段片段69494变变变变性性50-6550-65退火退火XX延伸延伸7 DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，缺点： Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每 次循环都要重新加入
6、。 引物链延伸反应在37下进行，容易发生 模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异 性较差，合成的DNA片段不均一。 由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变 性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完 成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序 添了不少困难。 8 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。91988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶特点：耐高温，在70下反应2h后其残留
7、活性大于原来 的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95 下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝 化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特 异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。10TaqTaq DNADNA聚合聚合酶酶（ （thermus aquaticus)thermus aquaticus)酶酶活性活性(%)(%)温度温度()40
8、 50 60 70 80 90 1001008060402011二、二、PCRPCR技技术术的原理的原理1 PCR1 PCR技技术术的基本原理的基本原理在微量离心管中在微量离心管中, ,加入适量的加入适量的缓缓冲液冲液, , 微量的模微量的模板板DNA,DNA,四种脱氧四种脱氧单单核苷酸核苷酸, ,耐耐热热性多聚性多聚酶酶, , 一一对对合成合成DNADNA的引物的引物, ,通通过过高温高温变变性性、 、低温退火低温退火和和中温延伸中温延伸三三个个阶阶段段为为一个循一个循环环, ,每一次循每一次循环环使使特异区段特异区段的基因的基因拷拷贝贝数放大一倍数放大一倍, ,一般一般样样品是品是经过经过
9、3030次循次循环环, ,最最终终使使基因放大了数百万倍基因放大了数百万倍; ; 扩扩增了特异区段的增了特异区段的DNADNA带带。 。 12体内体内DNADNA的复制的复制DNADNA聚合聚合酶酶dNTPdNTP解旋解旋酶酶类类引物引物5533知识识点回顾顾13加热加热变变 性性复复 性性复 温DNADNA的的变变性和复性性和复性加加热热或或强强酸、碱性作酸、碱性作用可以使用可以使 DNADNA双螺旋双螺旋的的氢键氢键断裂断裂, ,双双链链解离解离, ,形成形成单链单链DNA,DNA,这这称称为为 DNADNA的的变变性。性。解除解除变变性的条件后性的条件后, , 变变性的性的单链单链可以重
10、新可以重新结结合起来合起来, ,形成双形成双链链, ,其原其原有的特性和活性可以有的特性和活性可以恢复恢复, ,这这称称DNADNA复性复性, , 也叫退火。也叫退火。 14PCRPCR扩扩增原理增原理引物引物延伸延伸延伸延伸55553333变变变变性、退火性、退火变变变变性、退火性、退火152 PCR2 PCR技技术术的特点的特点1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性3030轮轮循循环环扩扩增量达增量达2 23030个拷个拷贝贝（ （10109 9拷拷贝贝） ）PCRPCR产产物每物每轮轮循循环环增加一倍增加一倍162 2 ）特异性）特异性引物的序列及其与模板引物的序列及其与模板结结合的特异性是
11、决定合的特异性是决定 PCRPCR反反应结应结果的关果的关键键。 。引物引物设计设计的最大原的最大原则则是最大限度地提高是最大限度地提高扩扩增效增效 率和特异性；同率和特异性；同时时尽可能减少非特异性尽可能减少非特异性扩扩增。增。引物引物引物引物173355355限制性内切限制性内切酶酶的的识别识别识别识别序列序列启启动动动动子序列子序列定点突定点突变变变变探探针标记针标记针标记针标记183 3）操作）操作简简便易行便易行PCRPCR扩扩增法增法, ,只需要数小只需要数小时时, ,就可以用就可以用电电泳法泳法 检检出出1g1g基因基因组组DNADNA中中仅仅含数个拷含数个拷贝贝的模板序的模板序
12、 列。列。通常的通常的DNADNA扩扩增法是分子克隆法增法是分子克隆法, , 首先要构建含有首先要构建含有 目的的基因的目的的基因的载载体体, , 然后将它然后将它导导入入细细胞后胞后进进行行扩扩增增, ,还还要要 用同位素探用同位素探针进针进行行筛选筛选; ;这这种方法种方法, ,要要经过经过DNADNA内切、内切、连连 接、接、转转化和培养等相关的化和培养等相关的过过程程, ,操作复操作复杂杂, ,一般需要数周一般需要数周 时间时间。 。19目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取DNADNA分子分子204）对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养
13、细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用各种生物标本（如血液、体腔液、毛发、细胞、活组织等）粗制的DNA扩增检测。215 5 ）用途广泛）用途广泛生命学科生命学科医学工程医学工程遗传遗传工程工程疾病疾病诊诊断断法医学法医学考古学考古学22三、三、PCRPCR的反的反应应体系和方法体系和方法PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的 作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链 。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中 温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的 基因拷贝数放大一倍,一般样品是
14、经过30次循环,最终使 基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙 锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA带。23总总体体积积 50-100 50-100 l lBuffer Buffer 缓缓冲液冲液dNTPdNTP 原料原料Primer Primer 引物引物DNADNA分子分子 模板模板 TaqTaq酶酶 DNADNA聚合聚合酶酶 1 1 反反应应体系体系24PCRPCR技技术术的基本的基本过过程程(1)(1)模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBuffer预变预变性性模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBu
15、fferTaqDNATaqDNA聚合聚合酶酶9494o oC C2 2 基本基本过过程程25PCRPCR技技术术的基本的基本过过程程(2)(2)Taq Taq 酶酶模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBuffer循循环环环环 仪仪仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBuffer72 72 5 57 min7 min26琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳PCRPCR技技术术的基本的基本过过程程(3)(3)27（ （1 1）模板）模板单单、双、双链链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白不能混有蛋白酶酶、核酸、核酸酶酶、 、DNADNA聚合聚合酶酶抑制抑制 剂剂、 、DNADNA结结合蛋白合蛋白类类。 。一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 L L。 。模板模板浓浓度度过过高会高会导导致反致反应应的非特异性增加的非特异性增加。 。3 PCR3 PCR反反应
