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1、第十六章 糖类药物总论 多糖类药物在抗凝、降血脂、提高机体免疫和抗 肿瘤、抗辐射 面都具有显著药理作用与疗效。 多糖是非细胞毒物物质，在细胞内的存在方式 有游离型与结合型两种。结合型多糖有糖蛋白、 脂多糖 第一节 糖类药物制备的一般方法 一：单糖及其衍生物的制备 游离单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇。 可以用水或中性条件下以50%乙醇为提取溶剂， 也可以以82%乙醇，在70-80摄氏度下回流提取 。 二：多糖的分离于纯化 多糖可来自动物、植物和微生物。来源不同提取 方法也不同。植物体内含有水解多糖衍生物的酶，必须抑制或破坏酶的作用 后，才能制取天然存在形式的多糖。速冻冷藏是保存提取多糖材料的
2、有效方法。提取方法依照不同种类的多糖的溶解性质而定。（）多糖的提取提取多糖时，一般先需进行脱脂，以便多糖释放。方法是将材料粉 碎，用甲醇或11乙醇乙醚混合液，加热搅拌13小时，也可用 石油醚脱脂。动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理。 1、难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者 多糖的提取方法主要有以下几种： 这一类多糖主要是不溶性胶类，如木聚精、半乳聚糖等。用 冷水浸润材料后用0.5molL NaOH提取，提取液用盐酸中和 、浓缩后，加乙醇沉淀得多糖。 如在稀碱中仍不易溶出者，可加入硼砂，对甘露聚糖、半 乳聚糖等能形成硼酸络合物的多糖，此法可得相当纯的物质。 2、易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者 材料用冷
3、水浸过，用热水提取，必要时可加热至8090 搅拌提取。 3、粘多糖 提取液用正丁醇与氯仿混合液除去杂蛋白（或用三氯 乙酸除杂蛋白），离心除去杂蛋白后的清液，透析后 用乙醇沉淀得多糖。 有些粘多糖可用水或盐溶液直接提取，但因大部 粘多糖与蛋白质结合于细胞中，因此需用酶解法或碱 解法使糖-白质间的结合键断裂，促使多糖释放 一般组织中存在多种粘多糖。需要对粘多糖进行分离 纯化 。 （1）碱解法 多糖与蛋白质结合的糖肽键对碱不稳定 ，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。 但若硫酸基与邻羟基处于反式结构或硫酸基在C-3 或C-6，此时易发生脱硫作用。这类多糖不宜用碱解法 提取。 （2）酶解法 理想的工具酶是专
4、一性低的、具有广泛水 解作用的蛋白酶。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近 的肽键，为除去长肽段，常可与碱解法合用。 常用的酶制剂有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白 酶及枯草杆菌蛋白酶。 （二）多糖的纯化试剂试剂 和器材 一、试剂试剂 平衡缓冲溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2。 洗脱液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2 。 氯仿、正丁醇、乙醇(95)等，均为分析纯。 二、材料 灰树花子实体。 三、 器材 DEAE Sepharose Fast
5、 Flow，旋转真空蒸发仪，摇 床，离心机，层析柱：2610操作方法一、粗多糖的提取将多糖子实体切碎烘干后称量，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1 ：5，浸提温度为7080，浸提时间35h，共提取4次，合并4次浸提 液。真空旋转蒸发浓缩，浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，即 以1的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。在浓缩液中加入3倍 体积的乙醇搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。 它只是一种 多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质 和无机盐，必须进一步分离纯化。二、粗多糖的纯化粗多糖溶液加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇3：1混合摇匀
6、)后，置恒温振荡 器中震荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心(3000rmin)分离，去除蛋白质。 然后浓缩，透析，加入4倍体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干。取样品0.1g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2的平衡缓冲液中。上样， 用Buffer A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2 进行线性洗脱，分部收集。各管用硫酸苯酚法检 测多糖。合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，即得多糖级分。第二部分多糖的鉴鉴定 实验原理采用薄层层析法分析
7、单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得 单糖斑点的颜色和Rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和Rf值，确定 样品多糖的单糖组分。多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、 红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)等技术，气相(液相)色谱质谱(GC HPLCMS)联用技术成为分析多糖更为有效的手段。本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱 图上表现为相应的特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类 物质。0H的吸收峰在36503590cm1，CH的I申缩振动的吸 收峰在29622853cm1，CO的振动峰为151016701之间的 吸收峰，CH的弯曲振
8、动吸收峰为14851445cm1，毗喃环结构 的C0的吸收峰为1090cm1。 试剂和器材 一、试剂 浓硫酸，氢氧化钡。 展开剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇 ：水：吡啶7：20：12：7：6：6。 显色剂:1，3二羟基萘硫酸溶液（0.21，3 二羟基萘乙醇溶液）：浓硫酸1：0.04（V/V） 。 单糖标准品。 二、器材 沸水浴, 玻璃板，傅里叶变换红外光谱。 操作方法 一、单糖组分分析 1薄层板制备：称取硅胶5g于50ml烧杯中，加 入用 12 mL 0.3molL 磷酸二氢钠水溶，用玻璃 棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上(7 5cm10cm)，110活化1h。即置有干燥剂的干
9、 燥箱中备用。 2点样：称取少许的多糖(01克)于20mL离 心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水浴水解2h， 然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉 淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准 品进行点样进行薄层层析展开。用点样器点样于 薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm ，点样直径为24mm，点间距离约为1.5 2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检 出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 3展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点 好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展 开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm（切勿将 样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定
10、距离（一般为1015cm），取出薄层板，晾干 。 4显色：将展开凉干后的薄板再在100烘箱内 烘烤30分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此 板在110下烘烤10分钟即可显色。 薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较 ，参考斑点颜色、相对位置及Rf值，确定样品中 有哪几种糖。试剂和器材一、试剂浓硫酸，氢氧化钡。展开剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶7：20：12 ：7：6：6。显色剂:1，3二羟基萘硫酸溶液（0.21，3二羟基萘乙醇溶液）：浓硫 酸1：0.04（V/V）。单糖标准品。二、器材沸水浴, 玻璃板，傅里叶变换红外光谱。操作方法一、单糖组分分析1薄层板制备：称取硅胶5
11、g于50ml烧杯中，加入用 12 mL 0.3mol L 磷酸二氢钠水溶，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃 板上(75cm10cm)，110活化1h。即置有干燥剂的干燥箱中备用 。2点样：称取少许的多糖(01克)于20mL离心管中，加入1M的 硫酸1mL，沸水浴水解2h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去 硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品进行点样 进行薄层层析展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基 线距底边2.0cm，点样直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm， 点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损 伤薄层表面。 3展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的 薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄 层板底边0.51.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密 封室盖，等展开至规定距离（一般为1015cm），取出 薄层板，晾干。 4显色：将展开凉干后的薄板再在100烘箱内烘烤30 分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在110下烘 烤10分钟即可显色。 薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑 点颜色、相对位置及Rf值，确定样品中有哪几种糖。
