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1、海南师范大学从环境中分离放线菌实验设计方案专业：生物科学班级：2010 级一班组长：陈丽娟组员：李万蕊、曹露露、朱嘉宁时间：2012 年 5 月 24 日一、实验目的1、学习从土壤中分离放线菌的方法。2、练习、掌握微生物接种、移植和培养的基本技术。掌握无菌操作技术。3、掌握无菌操作技术。二、实验原理放线菌是原核生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多 1。土壤颗粒的分散程度对于分离放线菌也有影响。钱恒段等 2报道，用胆酸钠处理土壤悬液后土壤分散效果较好，且优于纯蒸馏水。这可能是因为胆酸钠对土壤腐殖质具有较强的结合能力从而有利
2、于破坏土壤团聚结构。据杨宇容等 3报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌的抑制作用较明显，然而对放线菌并无抑制作用。而且其价格低廉，如安德荣等 4报道其可作为理想的放线菌分离抑制剂。徐成勇等 5实验证明酵母膏、SDS（十二烷基硫酸钠）也有抑菌的作用。本实验所用方法为综合徐成勇等 5及钱恒段等 2实验结果所得。三、实验材料1、样品干燥的营养基质丰富的苗圃土2、仪器铲子、牛皮纸、搪瓷杯、锥形瓶、玻璃棒、烧杯、小试剂瓶、标签纸、移液管、接种环、试管、记号笔、酒精灯、电子天平、电炉、恒温培养箱、加压蒸汽灭菌锅、电热干燥烘箱3、培养基及试剂配制（1）培养基（高氏一号琼脂+重酪酸钾培养基)配制:配方：可溶性淀粉
3、20g、K 2HPO4 0.5g、1mol/LNaOH、MgSO 47H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO 47H2O 0.01g、琼脂 20g、蒸馏水 1000ml、250mg重酪酸钾、PH7.27.4。步骤：用搪瓷杯先量取 500ml 自来水在电炉上加热。根据配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌均匀。可溶性淀粉称入烧杯中，加入50ml 自来水调成糊状，待培养液煮沸时加入淀粉糊，边加边搅拌，防止糊1底。之后，加入琼脂煮沸至完全溶化，补足 1000ml 水量。接着，缓慢加入NaOH 液，边加入边搅匀培养液，然后用 PH 试纸测其酸碱值，调 PH 至7.27.4。趁热分装于 8 个
4、三角瓶中，塞好棉塞。用牛皮纸包扎好，贴好标签。最后，高压蒸汽灭菌，121灭菌 30min.（2）试剂配制：1mol/LNaOH、6%酵母膏和用 5 mmol / L 磷酸缓冲液稀释的 0.05% SDS 四、实验方案1、土样的采集及处理（1）方法：在苗圃，按对角交叉（五点法）取样。先出去表层约 2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取 210cm 处的土壤于叠好的牛皮纸袋里。将土样放入三角瓶中，加入少量胆酸钠，再加适量蒸馏水振荡溶解制成土壤悬浮液。调节稀释液的 PH 为 7，略微加热后冷却至 40。之后，再加 6%酵母膏和用 5 mmol / L 磷酸缓冲液稀释的 0.05% SDS 震荡
5、20min。（2）原理：放线菌在较干燥的，营养基质较丰富的中性或微碱性土壤中分布较多；胆酸钠有利于分散土壤颗粒；一定浓度的酵母膏和 SDS 有抑制细菌、真菌的作用。（3）注意：所取的土样不可过湿，防止样品中杂菌过多；至土壤稀释液时要振荡充分，是土样与水充分混合，将菌分散。2、器材灭菌蒸汽灭菌制备无菌水。干热灭菌 9 个锥形瓶、平皿 10 个、玻璃棒 3 个、移液管 3 个、10 个试管3、分离（1）方法：将处理后的土壤悬浮液稀释 100 倍备用。加热已制备并灭菌好的高氏合成 1 号琼脂+重酪酸钾培养基，在无菌条件下倒 10 个平板然后，贴好标签，冷却。用平板稀释法 6（稀释度从 10-3 到
6、10-5,浓度设置见）将菌种接种在高氏合成 1 号琼脂+重酪酸钾的平板培养基上,28培养 57d。（2）原理：见上文实验原理。2（3）注意：稀释样品时要在无菌条件下进行；每个稀释度做 23 个培养皿，并做好标记；实验中要留一个空白对照；注意划线时的操作。 4、纯化（1）方法：57 天后，加热培养基，倒斜面。选择挑取效果较好的菌落用接种环接种于高氏 1 号斜面，28培养 57d。（2）原理：放线菌的群体特征 7：小型、干燥、不透明、与培养基连接紧密，难以挑取，表面呈致密的丝绒状，上有一薄层彩色“干粉” ，正反面颜色不一致，边缘琼脂平面有变形。（3）注意：实验过程要做好标记。五、实验预期结果由于时
7、间有限，不能对土样进行风干，可能会影响分离得到的放线菌的纯度。而且可能实验进行不到纯化这一步，仅停留在分离就必须终止实验。但是由于预先对土样进行的充分的处理，培养时也选用了针对放线菌的培养基并且加入了有效的抑制剂，即使没有纯化，分离后也可达到实验目的。参考文献1 赵斌,何绍江,等.微生物学实验M. 北京: 科学技术出版社,2002.2 钱恒段,淑蓉.放线菌选择性分离方法综述 J .安徽农学通报,Anhui Agri.Sci.Bull.2011,17（15):6061.3 杨宇容,徐丽华,李启任等.放线菌分离方法的研究 J .微生物学通报,1995,22(2):8891.4 安德荣,慕小倩,刘翠娟, 赵文军,等.土壤拮抗放线菌的分离和筛选 J .微生物学杂志,2002,22(5):13.5 徐成勇,袁野,黎丹辉,夏欢耕,诸葛健.选择性分离放线菌 J .无锡轻工大学学报,1999,18(2):4549.6 孙勇民,任超,范延辉.应用微生物学M. 北京：北京师范大学出版社 ,2007.37 周德庆。微生物学教程第 3 版M. 北京: 高等教育出版社,2011.4.
