《过表达E钙粘蛋白对TGFβ诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《过表达E钙粘蛋白对TGFβ诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中图分类号垦鱼鱼星! 鱼分类号U D C6 1 0硕士学位论文学校代码1 0 5 3 3过表达E 一钙粘蛋白对T G F - 1 3 诱导的腹膜间皮细胞转分化的影响E f f e c to fo v e r - e x p r e s s i o no fE c a d h e r i no ne p i t h e l i a l m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o nt h a ti n d u c e db yT G F 1 3 li np e r i t o n e a lm e s o t h e l i a lc e l l s作者姓名：
2、学科专业：研究方向：学院( 系、所) ：指导教师：副指导老师：杨淼临床医学内科学湘雅三医院张浩教授张柯主治医师答辩委员会主中南大学2 0 1 3 年5 月原创性声明J I l ll l l lJ l l H Ull lI I I I IU J Y 2 4 2 15 3 8本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。作者签名：物盏日期：趔上键月上三日学位论文版权使用授权声明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文
3、的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学文论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论过表达E 一钙粘蛋白对T G F 1 3 诱导的腹膜间皮细胞转分化的 影响摘要目的：E 钙粘蛋白( E c a d h e r i n ，E c a d ) 质粒( p l R E S 2 E G F P E C A D ) 转染人腹膜间皮细胞永生化细胞株( 如出S V 5 ) ，观察E c a d 的过表达对腹膜间皮细胞上皮细胞间充质转分化( E p i t h e l i a l M e s e n c h y m a l T r a n s i t i o n ，E M T ) 的影响。方法：( 1 ) 采用大
4、肠杆菌D H 5 a 进行p l R E S 2 一E G F P E C A D 质粒 及空白质粒( V e c t o r ) 扩增，酶切鉴定，R T - P C R 验证。( 2 ) 体外培养H M r S V 5 ，将H M r S V 5 分为正常对照组、E c a d 转染组、空质粒转染组，通过脂质体转染法( 1 i pL T X ) 转染 p l R E S 2 E G F P E C A D 质粒及空质粒，倒置显微镜下观察细胞形态学 的变化：流式细胞术评估转染效率，采用R T - P C R 、W e s t e r nB l o t 分别 观察转染后1 2 h 、2 4 h
5、、3 6 h 、4 8 h 、7 2 hE c a d 的r n R N A 及蛋白表达。( 3 ) 将H M r S V 5 分为正常对照组、T G F 1 3 刺激组，采用W e s t e r nB l o t 、细胞免疫荧光观察T G F B 刺激后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 hE c a d 、 a - S M A 的蛋白表达；验证T G F p 刺激对H M r S V 5E M T 的影响。 ( 4 ) 将H M r S V 5 分为正常对照组、T G F p 刺激组、p I R E S 2 - E G F P E C A D 质粒转染+ T G F p 刺
6、激组，通过脂质体转染法( 1 i pL T X ) 转染p l R E S 2 一E G F P E C A D 质粒，并分别给予T G F p 刺激， 采用R T - P C R 检测转染+ 刺激( 或单纯刺激) 后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 hE c a d m R N A 的表达，采用W e s t e r nB l o t 方法检测转染+ 刺激及单纯刺激后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h S M A 、V i m e n t i n 的蛋白表达；采用细胞免疫 荧光方法检测转染+ 刺激( 或单纯刺激) 后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、
7、4 8 hE c a d 、仅一S M A 的蛋白表达，观察E c a d 的过表达对T G F B 诱导的H M r S V 5 E M T 的影响。结果：( 1 ) 扩增质粒经限制性内切酶酶切电泳鉴定，R T - P C R 证实，扩增质粒序列无突变。( 2 ) p l R E S 2 E G F P E C A D 质粒转染H M r S V 512 h 细胞内E c a d m R N A 表达量最高，随后逐步下降，与正常对照组比较有差异 ( 矿O 0 5 ) ，转染后1 2 h 细胞内E c a d 表达开始上调，3 6 小时达到峰 值，随后逐渐下降，与正常对照组及空质粒转染组比较均
8、有显著差异( 0 0 1 ) 。 ( 3 ) T G F p 刺激H M r S V 5 后，细胞内仅一S M A 表达逐步上调，呈时间依赖性趋势，与正常对照组相比有显著差异( p O 0 5 ) ，见图3 3 。E C a dG A P D HN CE 1 2 E 2 4 E 3 6 E 4 8 E 7 2l II沣= tl 虻，i F 蕾对嘲龋E - E - c a d h a r i n 格抽确1 ：P 0 5图3 - 3 Ap l R E S 2 - E G F P E C A D 质粒转染后细胞E c a dm R N A 变化情况E - c a d 一- _ 鼻- 一一l ：t ，
9、K D G A P D H - - 簟囊_ - 一嘲耪一釉_ 3 一K D N CE 1 2 E 2 4E 3 6E 4 8V 1 2V 2 4V 3 6V 4 8l - lIli一。窜lps注：N c l 正常对照。E - E - c a d h e d n 转染组，V ：V e c t o r 转囊组：P 0 1 ，：P O 0 5图3 - 3 Bp l R E S 2 E G F P E C A D 质粒转染后细胞E - c a d 蛋白变化情况2 43 4T G F p 诱导H M r S V 5 细胞E M T 的发生正常的H M r S V 5 细胞贴壁生长，排列紧密，呈典型的铺路
10、石样，见图3 3 A 。T G F p ( S n e d r r f l ) 刺激后细胞发生上皮细胞间充质转分化，形态发生改变，显微镜下可见细胞排列失去原有的整齐性，逐渐变细变长，呈梭形改变，少部分细胞脱落，细胞密度较正常对照组稀疏，该变化呈时间依赖性，以4 8 h 变化明显，见图3 - 4 A 。采用W e s t e r n b l o t 检测E c a d 蛋白的表达，结果显示：T G F 1 3 刺激后1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 伍S M A 表达上调，各组与正常对照组比较，差别均具有统计学意义仞 0 0 1 ) ，见图3 - 4 B细胞免疫荧光方法检测G
11、 t S M A 表达也同样随时间延长而增加。上述结果均提示：T G F p 刺激H M r S V 5 ，可诱导E M T 的发生，见图3 - 4 C 。图3 - 4 AT G F - I g 刺激H M r S V 5 细胞发生形态改变( 1 0 1 0 X )( 卜S M A - - - 一- 4 3K D G A P D H ，一I_ ，- ，3 7K DN CT 1 2T 2 4T 3 6T 4 8 = 盆：+摹一I i I ：0 L L I _ _ lg r o u p S注：N C ：正常对照组T ：T G F - B 刺激组，：户0 0 1图3 4 BT G F - I g 刺
12、激后细胞o - S M A 蛋白表达变化2 5亟堂焦j 佥苤塞丝结墨4 0 0 X注：激光共聚焦墨徽奠，绿色俺号。a - $ M A 童色信号e 细胞孩图3 - 4 CT G F - I B 刺激后细胞a S M A 蛋白表g g l g ( 激光共聚焦显微镜，1 0 4 0 X ，1 0 8 0 X )3 5 过表达E c a d 对T G F - p 刺激H M r S V 5 细胞E c a d 、a - S M A 、 V i m e n t i n 表达影响R T - P C R 法检测转染p I R E S 2 E G F P E C A D 质粒并给予T G F p 刺激后，H
13、M r S V 5 细胞E c a d 表达变化，用G A P D H 作为内参。结果显示：p I R E S 2 一E G F P E C A D 质粒转染并给予T G F p 刺激后12 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 细胞E c a dm R N A 表达下降，与单纯T G F B 刺激组比较，刺激后相同时间点差别均具有统计学意义( p 0 0 1 ) ，各组与正常对照组比较，差别均具有统计学意义( 庐0 0 5 ) ，见图3 - 5 A 。采用W e s t e m b l o t 检测转染p I R E S 2 E G F P E C A D 质粒并给予T G F B
14、刺激后，H M r S V 5 细胞V h n e n t i n 、S M A 蛋白的表达，结果显示：转染+ T G F B 刺激后12 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 hV i m e n t i n 、G t S M A 表达上调，与单纯T G F B 刺激组比较，刺激后相同时间点，各指标差别均具有统计学意义( p O 0 1 ) ，各组与正常对照组比较，差别均具有统计学意义p O 0 5 ) ，见图3 5 B 。细胞免疫荧光方法检测( 一抗浓度1 ：3 0 ) 转染p I R E S 2 一E G F P E C A D 质粒并给予T G F D 刺激后，H M r S V
15、5 细胞E c a d 及a S M A 蛋白的表达，结果与R T - P C R 、W e s t o - n b l o t 结果一致，其中正常细胞在该一抗浓度下，并不能染出E 钙粘蛋白，检测工具为激光共聚焦显微镜，分别为1 0 x 4 0 X 、1 0 8 0 X ，见图3 5 C 。细胞免疫荧光方法检测单纯T G F B 刺激组与p I R E S 2 - E G F P E C A D 质粒转染+ T G F B 刺激组q S M A 蛋白的表达变化，能看到干预组a S M A 表达明显减弱，4 8 小时候有趋于一致的趋势，检测工具为共聚焦显微镜，倍数1 0 x 4 0 X 、见图3 5 D 。E c a dI二注：眦t 正常对照组，T z f 钟_ 激组，E r ：E I 懒转絷+ 1 6 F 巾秘激组，( 与正常对照组比较) 取n 诅，并( - 鱼j T m 比较) P O 0 1图3 - 5 AE - c a d 转染+ T G F - 1 3 刺激后细胞E - c a d h e r i nm R N A 表达变化V i m e n t i n 一一5 5K DO - S M A一。一一一4 3K DG A P D H一一一一- 一B , g - 一3 7K DN CT l ：囊4T 3 jH 8E 2 4 尊j2E 亿4 6 r - 4 8r 一一工 1
