《胆囊胆固醇结石病人肝组织MDR3 mRNA表达的半定量研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胆囊胆固醇结石病人肝组织MDR3 mRNA表达的半定量研究（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学硕士学位论文胆囊胆固醇结石病人肝组织MDR3 mRNA表达的半定量研究姓名：隋春阳申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：郭仁宣20030301中文摘要前言、一腮囊胆圈醇结石是种常见的消化系统疾病。目前的流行瘸学谲磷研究裘晴，艟固醇结石与家族遗传有关。疆石的形成可能滚予笺杂翦环境终爱霸潦不鼷了的多基因作爨。疆囊疆嬲醇结石癍表现为胆汁中腮固醇的内环境的失衡，即胆圈醇柱胆汁中溶解 的生瑾生诧平衡被打熬。艇汗中醣磷脂，主要是辩磷囊在蘧泞中与腿汁酸攀驵隐醇分子构成微胶粒，并和胆圈醇组成微泡，它可以使镦胶粒增大，罐高艇盐携带髓黼醇的能力，同时也可赢接增加鼹匿酵在耱汁中转溶解，濒黪照匿酵终热熬
2、树篷两彤藏皱石。毽此，磷代谢的变化就可能成为胆石形成的危险因素。而目前的研究表鼷，M D R 3 与邸磷脂熬分泌有关。本实验鹭在邋遵应惩F i T p C R 戢方法对胆囊胆酵结石瘸人与胆囊非胆劂醇结石人的M D R 3 基因表达的对比来探讨M D R 3 在聪囊腿阐醇结石形成中静作用。， 7 蔡验材料标本亲源：实验缀为2 0 0 2 年2 3 年疆囊锺鬻醇绩石患者的肝缝织1 4 例，收集的样本均为熙囊手术的瘸人术中行肝穿刺褥得。对照纽为菲腮结石入的肝组织，其中l 侧为胆囊癌肝侵润患 者戆瘸旁歪常戆肝缓绞，l 例搀器瘗瘗舅的歪常嚣缀织，墨3 剿舞尸体的肝组织。祷测标本均鬣于一7 0 冰箱保存。
3、实驻经器：P C R 扩潜仅； 乐温离心税；匀装槐i 毫濂铰；无菌撩撵台；离压锅；攫滋糖；凝步 分光光度计；各种微量扭撵器；烤箱。实验试剂：T r i z o l ( i n v i t r o g e n 公司) ，反转录试剂窳( p r o m e g a 公篙) ，T a gD N A 聚会酶( 牮美公霹) ，蘸臻( 华美，D N Am a r k e r ( 华美) ，戈水乙醇，异葱醇，D E P C ，氯仿，T r i s 碱，E D T A ，硼酸，蔗糖，溴酚蘸，浓硫酸，照铬酸钾，T E M E D ，过硫酸铵，硝酸，硝酸镶，福尔马林，穰酸镧，己黢，嚣涵，嚣稀鬣黢，警叉双瓣烯虢黢等
4、试裁。实验方法i 。组级慧致烈A 提取2 逆转录P C R3 。P C R 反应殿：签定4 m R N A 表达的半定量分析结象胆囊结石患者的肝组织中M D R 3m R N A 的表达比非胆囊络石 - - _ _ _ ；= h “一一 的入的肝缀织中的表达显著降低( P 1 6 0 ，各样本在做R T 时均取3 u g 总R N A 进行 逆转录；( 2 ) P C R 扩增步骤中各样本c D N A 加入攮完全相同。应鼹凝胶成像系统摄取各撵本，在霹一凝蔹上的毫泳匿，通过裁豫分析s c i o n 软件计算比较每一泳邋中P C R 产物条带的光密度值，计算M D t t 3 与舀一a c t
5、 i n 条带的光密瘦的裙对诧值，通过沈较各样本的M D R 3 相对值，最终得撼M D R 3 在肝组织中m R N A 表达棚对含量。结果将各样本l i T P C R 产物的凝胶泡泳翻摄入凝胶成像系统，每一泳道中的B a c t i n 条带的光密度德均设定为l ，应用凝胶成像系统分析软件中的P c R 定詹，分别求出每一泳道中M D R 3 条带光密发值与一a c t i n 巍密度篡的跑僮，鞠力每一基篷m R N A 表达的相对值。l l ，凝黢电滚烫翔下：m a r kM D R 38 一a c t i n应耀S P S S 软l 譬进行统计分析的结果如下袭：统计绪果Fp藩簿( 2
6、 一斟。8硼础)9 i f f e r e n e ed E r r o r D 溅缸9 5 稻C 幽d e n k t e r 性I 。f t h e酶m ”eL o w e rU p p e r7 5 8 407 1 0 51 701 3 4 90 1 8 9 9一1 7 50 。9 4 8 63m 互 要21统计的散点图如下：IXL a b e l sC o n t r o lT r e a t e dIM e 3 n2 4 0 4 0 5 5lS t dD e v i a t i o nD6 8 1 3 601 6 6 9| M 8 a n S E Mo fc o l u m n A2
7、4 0 403 0 8 0 N = SlM e a n4 - S E Mo fc o l u m nB10 5 5口0 4 4 8 0N = 1 4 | D i f f e r e n c eb e b “e e nm e a n s 3 4 90 1 8 9 9l9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l17 5 0C 0 09 4 a 6Pv a l u eP 8O O O i Pv a l u es u m m a r y A r em e a r l ss i g n i f 。d i f f e r e n t ? f P 00 5 lY e sO
8、r i b o rt w o t a l i e dPv a l u e ?下w 0 一t a i l e dt d ft = 71 D 5d r = 1 了C o n 牡0 lT r e a r e d其结果显示，胆囊结石患者的肝组织中M D R 3m R N A 的表达比菲腥囊结石的入的肝组织中的表达显著降低( P O ，0 1 ) 。讨论多耋耐药( M D R ) 基嚣藩予一大类P 一糖蛋巍( P g P ) 怒鏊霞家族，M D RP g P 位于细胞的裘面，它结合底物并通过A T P 的水解将萁逆底物的浓度梯发而泵过膜。在1 9 8 6 年，M D R l 是第一个被发 理的翳缨胞鳇A
9、 四依赖的转运予p 。由予当时耀来鉴别M D R 蛋白家族( 在小鼠为m d r l ，2 ，3 ；在人类为M D R l ，3 ) 的抗体C 2 1 9 没有特异靛，西羹艺秆缨施上的M D R 蛋自的类型并不麓被确定。隧着特异 生肽的抗体的应用，发现8 0 的肝细胞膜上的M D R 蛋白为m d r 2 ( 在人类为M D R 3 ) 岿】。m d r 2 的作用在不断的被研究。直 裂S m i t 等舞发浅m d r 2 等俊基隧缺失鳇小鼠( 溅蛇一或 m d r 2 裸鼠) ，发现这种小鼠完全不能分泌卵磷脂进入胆汁。PB o r s t 2 1 等人的研究发现郛磷腊豹分泌郾依靠胆盐也依靠
10、m d r 2瑰p 。如果任倪一个缺失那么郝将看不到卵磷脂的分秘。如果胆- 1 3 盐的浓度一定，卵磷脂的分泌依靠m d r 2P g P 的浓度。在野生型的 夺鬣m d r 2 ( + + ) 中舜磷脂鲔分泌眈在杂合小鼠m d r 2 ( + 一) 高。而在转M D R 3 基因的小鼠中其分泌最褰，其内的卵磷脂的跨膜转运子的浓度高于生理水平。而在m d r 2 ( 一) 小鼠中卵磷脂 的分泌蔓量常低。因此推测N D R 3P g P 麓舞磷艚鳇跨簇转运子。本研究通过对胆固醇结石病人及非胆固醇结石人肝细胞的 I , I D R 3 的m R N A 表达的半定量分析发现，艟固醇结石病人的肝细
11、胞的M D R 3m R N A 的褒达低于非胆匿醇结石人群，提示M D R 3P g P在胆固醇结石形成中起到了一定的作用。由于M D R 3P g P 是卵磷 黪酶跨蒺转运子，絮暴人肝缨胞中的M D R 3m R N A 薛表达降低将 导致M D R 3P g P 的减少，因此也就会导致卵磷脂分泌的减少。而卵磷脂是胆汁中的重爱成分，卵磷脂在胆汁中与胆汁酸和胆圈醇分子构成微胶黢，并季跬胆固醇组成微泡，它可以嫠微胶糙增大，提高胆盐携带胆固醇酌能力，同时也可直接增加胆闯醇在胆汁中的溶辩，以跨胆霞醇结磊的褥穗磊形残缭石。疆汁巾的癸磷l 旨髂减少就会使胆汁中的胆阉醇卵磷脂的比值增加，使胆固醇的溶解减
12、少，从而为膳固薛结看的形成创造一个有利的环境。这同目前公 认的艟汁中的腮国醇卵磷脂的毖僮增高是鼹匿醇结石形成酌一个重要因素的结论相一致。这也与其他学者的研究结论相一致。在小鬣中，m d r 2 ( 人类M D R 3 的露源基因) 等位基因缺失的小酝中胆汁的胆圈醇的绝对量是低的，但是其是过饱和的并有胆石的形成。S h o d aJ 等o u 人的研究指出M D R 3 的m R N A 水平在肝内髓管结石熬病人中的翳缨躯中餐显著憋降低，疆汁麓郛磷脂的浓菠毫 有明显的减少。与M D R 3 的缺失或突变有关的进行性家族性肝细胞淤胆的患者往往发展为腱筒醇结石。驻上均说明M D R 3 与胆结石的形
13、成可能存在一定关系。至于有关胆固醇结石病人中肝细胞的M D R 3m R N A 的减少的藤嚣我认为哥煞番蔽下咒令嚣匿：第一，N D R 3 基因麓交异。愁有1 4 研究表明M D R 3 基因麓交冥与胆囊胆溷醇结石有关。R o s m o t d u cO 等p 。人的研究表明M D R 3 基因酶突交是成人疆圈酪结石疾瘸的一个遗传因素。第二，M D R 3 基因谶控懿异常。S h i n y aW a k u s a w a 等拶。入翡磷究表弱外界的某些因素人类翳缨胞中薛M D R 3 的表达降低。目前有美M D R 3 表达异常的舆体原因尚须进一步研究。 另外，由于本研究的样本较少，因诧
14、尚需要更多的研究采嚼确M D R 3 与膳结番形成的详细关系。小结为探讨M D R 3 在膳囊膳匿醇络石形成中的作用，应用R T P C R 的方法对腿囊艟醇结石病入与茸车髓囊腥飚醇结石入的M D R 3 基因表达进行半定量检测。1 4 衡耱囊疆淄酵结石病人的肝组织标本的M D R 3 1 3 一a c t i nm R N A 的表达平均为1 0 5 5 2 ，胆囊非耱匿醇结石人的肝组缎的M D R 3 一a c t i nm R N A 的表达平均为2 4 0 4 5 ，两组比较具有明显的差异( P 0 0 1 ) 。疆囊腮固醇缮石病 人的M D R 3 m R N A 的表达眈非腌结石人
15、的明显减少。实验结果提示M D R 3 在胆蠖臆固醇结石的形成过程中发挥着作用。其为今后胆结石的预防和治疗提供了一个新线索。结论一、艟囊膛固醇病人的M D R 3m R N A 的表达降低。 二、M D R 3 作为肝细胞上的卵磷脂的转运子在胆囊胆固醇结石的形成过程中起作用。1 5 本研究的新见解本研究通过对M D R 3 基因表达的半定量测定探讨了M D R 3在胆囊胆固醇结石形成中的作用，提示M I ) R 3 在胆囊胆固醇结石 的形成过程中可能有一定的作用，这为今后对胆囊胆固醇结石的成因的研究及预防和治疗提供了一个新的思路。1 6 参考文献l 。巢阶平，裘法裎，等黄家骝外科学( 第六版)
16、2 B o r s tP ，Z e l c e rN ，v a i lH e l v o o r tA A B Ct r a n s p o r t e r si nl i p i dt r a n s p o r t ，B i o c h i mB i o p h y sA c t a2 0 0 0J u n2 6 ；1 4 8 6 ( 1 ) ：1 2 8 4 43 L i n c k eC R ，S m i tJ J ，v a nd e rV e l d e K o e r t sT B o r s tP S t r u c t u r eo ft h eh u m a nM D R 3g e n ea n dp h y s i c a lm a p p i n go ft h eh u m a nM D Rl o c u s ，JB i dC h e m1 9 9 1M a r1 5 ；2 6
