《心肌肥厚相关的细胞色素b和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《心肌肥厚相关的细胞色素b和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达的研究（69页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国协和医科大学硕士学位论文心肌肥厚相关的细胞色素b和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达 的研究姓名：刘俊明申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：陈兰英2002.10.1孛f ，i 枷和医样大学中屋蓬掌辩学院颤- 磷究生论文心肌肥厚相关的细胞色素b 和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达的研究摘要随着医疗水平的提高，溶栓、冠脉搭桥等技术的提高和推广，中风、急性心援等疾病豹死亡率逐渐下降，在5 年生存率提高的同时，心就肥厚、心寂等慢性心脏病患者的比例在增加。为更有效地防治和逆转心肌肥厚，减少心衰的发生，对心肌肥厚发生、发展机理的研究显得尤为重要。从中心法则可知，基因是决定表型的关键所在，近
2、年来，各种重大疾病相关基因的分离己成为揭示疾病发生机制的重要内容。分离心肌肥厚相关基因，并对其表达调控的研究，将为阐明其发病的分子机制，以及预防和治疗心肌肥厚提供有益的信息或线索。我们通过差减杂交分离压力负荷型心肌肥厚的相关基因的获得了一些差异片段，并对其中的两个片段进行了进一步的研究。方法：本文选用腹主动脉绑扎( 缩窄) 的大鼠作为压力负荷型心肌肥厚的动物模型，运愿m R 烈A 反转录的e D N A 的差减杂交，分离心飘肥厚发生过程中的相关基因；运用R A C E 对其中感兴趣的基因克隆其全长，并进行时间和组织特异性表达分析。( 1 ) 采用常规的腹主动脉缩窄法( 雄性健康W i s t
3、a r 大鼠，体重2 0 左右) 建立压力负荷型左心室肥厚大鼠模型：对照鼠行假手术，即除不进行腹主动脉缩窄外其余手术过程同实验组。( 2 ) 在手术后1 天、3 天、术后4 周提取左心室心肌组织R N A ，反转录合成e D N A ，经补平并加上合成接头，再经P C R 扩增后进行45 轮差减杂交；剩下的e D N A 片段插入载体的多克隆位点后转化受体菌，筛选后建立差减文库；经菌落原位杂交，挑选出其中杂交信号有差异的克隆子；最后对其中的部分克隆子进行序列测定和同源性比较。( 3 )对其中一一个片段3 0 , 的序列分析发现，其与细胞色素b ( c y tb ) 脱鞲基蛋白有很高的同源性，另
4、个片段1 8 3 与线粒体肌酸激酶( M i t o c h o n d r i a lC r e a t i n eK i n a s e ，m t C K ) 有很高的同源性，因而对它们进行了迸步的研摘要中髀和医科火学中嗣跃弓。科学院颤列 究生论文究。以S M A R TR A C E ，刑它们进行了全长基因的扩增、克隆和测序。( 4 ) 利用N o r t h e m 杂交，比较了c y t b 幂u m t C K 基因在负荷4 周后的几种组织中的表达，并对它们神：左，1 1 , 中不同时| 百j 点I 天、3 天、4 周、8 周的表达进行了研究。( 5 ) I Nc y tb 与辅酶
5、q 结合并与线粒体功能相关，为此本文用高效液相色谱( H P L C ) 进行了左室一t l , 肌线粒体中辅酶Q 9 含量的测定。( 6 ) 采用S o u t h e mE p i d , 杂交进行了左室心肌中线粒体D N A 拷贝数相对含量的测定。( 7 ) 用比色法测定了左室心肌中S O D 的活力。( 8 ) 以W e s t e r n 印记杂交检测了左室心肌中线粒体肌酸激酶的蛋白含量。结果：( 1 ) 模型的建立：术后3 天、4 周和8 周后实验组和对照组颈动脉平均压( m m H g ) 分别为：8 2 2 9 1v s8 8 3 1 1 3 ，n s ；1 0 8 9 8 7
6、v s8 6 9 6 6 ，p a g t c c g a a t t c a a g c a r l 3 0 0 b p ) ，以分离的c D N A 片段为模板。以接头l 链作为引物进行P ( ：R 扩增。P C R 条件为：9 5 预变性2 m in ，然后迸入循环扩增，9 56 C3 0 s 5 06 CI m i n 7 F CI n ，兵3 0 个循环。以光敏生物素标记的手术组c D N A 作为I ) r Iv e F ，对照绸c O N A 作为T c sc ( ! r 进行45 轮差减杂交( T e s t e r ：O r t ，r = l ：1 0 ) ；其它组别操作与此
7、棚似，只是将材引耵f 打遗3 3中围协和医科大学中国医学科学院硕士研究生论文对照组c D N A 作为D r i v e r 手术组e D N A 作为T e s t e r 互换。6 8 液相杂交1 6 2 0 h 后，加入链亲和素孵育，随后以酚：氯仿除去生物素标记的D N A 双链和单链，抽提后剩余的e D N A 按照上述步骤进行新一轮杂交，4 5 轮差减杂交后剩余的e D N A 以E c o R I 酶切并克隆入载体p B l u e S c r i p t K S ，重组质粒转化受体菌J M l 0 9 ，建立各时间组相应的差减文库。5 R A C E 法扩增e D N A按S M
8、 A R T “R A C Ec D N A 扩增试剂盒说明进行操作，根据已知片段分别设计出5 及3 R A C E 引物，设计3 0 。5 引物为：5 G T C C T C A T G G G A G T A C A T A G C C C A T A 1 A C C T A C A C G C C A A C G G C C c T C T l 、G T A ( ；G T A G C G A c c A G c C A G A l 、C C C A 1 、A C C T A C A C G C C A A C G G C C C T C C C C A T T C T 1 、A T C
9、G C C G C A C T G G T T G G C C T C C G A T T C T T G l - A G l l A G C G A C C A G C C A G A T C C T C T C G G G C A G A A A G A A G G G A G G T T C A C T G C C A C C C A G A A G A C T G T T G A A G T C G C A G G A G A C A A T C A G A G T A A C G A C G A G G T A T C A G G G t l 、C G A q - T C C G G
10、 A G G T c c T c A T G G G A G T A C A T A G C c c A T ( 3 ，再根据5 R A C E 所得的序列设计3 R A C E引物( 见F i 9 2 B中划线部分) ：5 A T A C C T A C A C G C C A A C G G C C C T C ( 第二版) 。3 6 6 - - 7 1 ，5 ，颜子颖，王海林译， 。3 3 2 3 6 L a n gJ K ，P a c k e rL Q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fv i t a m i nEa n
11、do x i d i z e da n dr e d u c e dc o e n z y m eQb yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw i t hi n l i n eu l t r a v i o l e ta n de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t S o n ，JC h r o m a t o g r 1 9 8 7 ；3 8 5 ：i 0 9 一】77 B a r a z z o n iR ，S h o r tK R ，N a
12、i rK S ，E f f e c t so fa g i n go nm i t o c h o n d r i a lD N Ac o p yn u m b e ra n dc y t o c h r o m eco x i d a s eg e n ee x p r e s s i o ni nr a ts k e l e t a lm u s c l e ，l i v e r , a n dh e a r t JB i o lC h e m 2 0 0 0 ；2 7 5 ：3 3 4 3 7 8 颜子颖，王海林译，c 。5 8 9 9 颜子颖，王海林译， 。3 5 6 1 0 金冬雁，
13、黎盂枫等译，( ( 第二版) 。8 8 8 - - 9 7 11 R o s s iA ，L o r t e tS E n e r g ym e t a b o l i s mp a t t e r n si nm a m m a l i a nm y o c a r d i u ma d a p t e dt oc h r o n i cp h y s i o p a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n s C a r d i o v a s cR e s 1 9 9 6 ；3 1 ：1 6 3 7 1 R e v i e w 12 B e y e rR
14、 E ，B u m e t tB A ，C a r t w r i g h tK Je ta 1 T i s s u ec o e n z y m eQ( u b i q u i n o n e ) a n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n so v e rt h el i f es p a no ft h e参考文献6 5主里堡塑墨型查兰垒! 里墨兰型兰垦堡主竺! ! 兰笙苎一l a b o r a t o r yr a t M e c hA g e i n gD e v19 8 5N o v ；3 2 ( 2 - 3 ) ：2 6 7 81 1
15、 3 S c h o n e k e s sB O ，A l l a r dM F ，L o p a s c h u kG D P r o p i o n y lL c a r n i t i n ei m p r o v e m e n to fh y p e r t r o p h i e dr a th e a r tf u n c t i o ni sa s s o c i a t e dw i t ha l li n c r e a s e i nc a r d i a ce f f i c i e n c y E u rJ P h a r m a c 0 1 1 9 9 5 ；2
16、8 6 ：1 5 5 6 6 1 4 Z h e n gJ S ，B o l u y tM O ，L o n gXe ta 1 E x t r a c e l l u l a rA T Pi n h i b i t sa d r e n e r g i ca g o n i s t - i n d u c e dh y p e r t r o f ) h yo f n e o n a t a lc a r d i a cm y o c y t e s C i r cR e s 1 9 9 6A p r ；7 8 ( 4 ) ：5 2 5 3 5 15S c h o e p pB ，B r e t o nJ ，P a r o tPe ta 1 R e l m i v eo r i e n t a t i o no ft h eh e m e
