组织制片技术概述

《组织制片技术概述》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组织制片技术概述（43页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、组 织 制 片 技 术主讲：张端莲组织制片的意义和目的 组织标本制作的方法组织切片标本制作的基本程序苏木精伊红染色的程序组织制片的意义和目的组织制片技术是随着生命科学的发展而不断进步的。利用组织切片染色(staining)的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态，它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的依据。因此组织制片是研究医学和生物学的一个最基本和最重要的手段组织标本制作的方法 组织切片法 非组织切片法 组织切片法 利用化学试剂将组织经过一系列的固定(fixation)、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组

2、织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋(embedding)成块，然后依靠切片机(microtome)将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。 石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片冰冻切片 非组织切片法 组织不经过切片手续制成的 观察标本的方法为非组织切片法。包括：涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、 活体标本、整装标本、血管注射标本。涂片 将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上 经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。压片 先将组织处理成小块物质，然后经化学药 品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标 本。例如运动终板等。 铺片 将需要观察的薄片组织用手工的方法

3、直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。磨片 骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。消化分离 将组织分离成小块，然后利用相应的化学药品水溶液将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上封固的标本。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。活体标本 将所采的观察标本加生理盐水后直 接滴于载玻片上在显微镜下观察。整装标本 一种是将胚胎或小动物经前期固定 后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。

4、另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固 定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。血管注射标本 一种是将有色物质注射进 血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整 体封藏的血管标本。另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列 制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的 标本。 组织切片标本制作的基本程序:取材固定固定后处理脱水透明浸蜡包埋切片染色封固 取 材动物的处死处死动物要求手法迅速、快捷，避免动物因过度痛苦 而产生组织细胞的变化。 处死动物的几种常用方法：麻醉法空气栓塞法 击头法颈椎脱臼法破坏脑和脊髓股动脉放血取材的方法：选择动物选择取材部位选择切面方向根据实验工作的目的选择动

5、物 取材应根据实验工作的目的选择动物的种类、组织部位和材料大小。肝脏猪肝卵巢猫胃狗运动终板爬虫类动物肥大细胞大、小白鼠的皮下组织间皮和内皮蛙的肠系膜铺片最好根据器官组织的结构特点选择部位： 胰腺胰尾部脊髓的运动神经元颈膨大和腰膨大处肺 肺门胃胃底部 根据器官组织的结构特点选择切面方向肾脏肾门处作纵切头皮顺毛根的方向纵切大小肠的环行皱襞纵切气管和食管横切 应注意的问题 ：组织新鲜注意环境温度的影响材料应小而薄 1515 05厘米3 防止组织变形防止组织损害防止组织污染固定和固定剂 固定的目的 ： 防止组织细胞产生自溶和腐败使细胞易于着色使组织适度硬化固定的方法：直接固定蒸汽固定灌注固定 ： 局部

6、灌注固定全身灌注固定。固定的注意事项：固定剂的用量 一般为组织块体积的15倍左右 固定剂的配制 现配现用最为理想还原剂（如甲醛）尽量不要与氧化剂（如重铬酸钾）配伍 固定的时间 一般情况下固定24小时既可达到固定要求。 固定后处理 ：流水冲洗 脱黄 脱汞 脱甲醛色素 组织漂白 脱钙（酸溶液脱钙 、螯合脱钙 、电解脱钙 ） 固定剂单纯固定剂 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重铬酸钾、丙酮、 铬酸、四氧化锇 混合固定剂 中性甲醛液、乙醇甲醛液、 Bouin氏液、苦味酸硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液甲醛(Formeldedhyde)固定浓度： 10%-20%水溶液固定时间： 12小时2

7、4小时固定后处理： 流水冲洗12小时24小时配制方法： 甲醛原液10ml20ml生理盐水（或蒸溜水）90ml80ml特性： 甲醛原液浓度为40%。甲醛放置时间过长易产生 白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸 性，严重时可影响到细胞核着色。因此需长期保存的甲 醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。酸性 甲醛固定的组织易产生甲醛色素，固定后须用硷性溶液 洗涤 乙醇(Ethyl alcohol) 固定浓度： 80%-90%乙醇液 固定时间： 一般4小时12小时 固定后处理： 直接入脱水剂 配制方法： 无水乙醇80ml90ml 蒸馏水20ml10ml 特性： 乙醇易被氧化成乙醛继而

8、变为醋酸，所以不能与铬酸、 重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。乙醇具有固定、脱水等多种功能 ，单独作固定剂使用时其渗透力较差，因此取材应薄，才能固定 好。经乙醇固定的组织细胞核着色较差。高浓度乙醇（通常指 90%浓度以上）不溶解细胞内糖原，宜做保存糖原的固定剂。组 织在高浓度乙醇中放置时间过长时，收缩明显，易发脆，影响制 片。50%以上浓度的乙醇可溶解组织内脂肪、类脂体、色素等， 因此不能用作以上物质的固定剂。 中性甲醛液配制方法： 40%甲醛 120ml 蒸馏水 880ml磷酸二氢钠 4g 磷酸氢二钠 13g固定时间： 24小时。固定后处理： 流水冲洗24小时。适用组织： 实验室常备固定剂，适用多

9、种组织的固定。 乙醇甲醛液（AF液）配制方法： 95%乙醇90ml 40%甲醛10ml固定时间： 组织块固定412小时，铺片固定510分钟。固定后处理： 直接入脱水剂。适用组织： 组织中的肥大细胞，组织化学中对糖原的固定等等。 Bouin氏液固定皮肤 苦味酸硫酸液胚胎组织，尤以固定鸡胚最好 Carnoy氏液糖原、染色体、尼氏体等 Helly氏液骨髓、脾、肝等造血器官及胰岛、脑垂体前叶等含特殊颗粒的细胞 脱水和脱水剂 脱水脱水剂 乙醇、丙酮、正丁醇 乙醇 既是固定剂又是实验室常用脱水剂，脱水能力强，能与二甲苯等透明剂较好地混合。用乙醇脱水时遵循从低浓度向高浓度的梯度脱水原则。一般组织从70%浓度

10、开始至无水乙醇，胚胎组织从30%浓度开始。组织在高浓度乙醇中停留时间不能过长，否则将会使组织脆化。 丙酮 沸点56，脱水能力比乙醇强，但对组织的收缩脆化作用也比乙醇强，因此主要用于组织的固定兼脱水或切片的快速脱水，以保护某些特殊染色的标本不被褪色。正丁醇 沸点100-118，脱水能力较弱，但很少引起组织的收缩和脆化。因能与乙醇和石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡包埋。脱水方法：组织块经固定洗涤后入50%、70%和80%乙醇中作基础脱水，然后转入正丁醇中脱水1224小时，再浸蜡包埋。透明和透明剂 透明透明剂 二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷 、冬青油 二甲苯 为无色透明的液体，易挥发，长期接

11、触对呼吸 道粘膜有较强的刺激作用。二甲苯透明能力强。但组织在 二甲苯中浸泡时间过长时较易发生过度收缩和脆化现象。 用二甲苯透明时，小块组织20分钟至1个小时，大块组织 可适当延长时间。如果组织块在透明时呈白色浑浊不透明 状态时，则为脱水不彻底所致。此时应返回重新脱水。苯甲酸甲脂 为无色透明的液体，易挥发，透明能力强，对组织块的收缩和脆化的影响较小。透明时间12-24小时。组织块经各级乙醇至95%浓度脱水后可直接入苯甲酸甲脂透明。由于苯甲酸甲脂可溶解火棉胶，也可用于火棉胶切片的透明。三氯甲烷 也称氯仿，无色透明的液体，极易挥发，透明能力较差，透明时间可长达24小时，但氯仿不易使组织收缩和变脆。目

12、前广泛用于火棉胶胶块的透明。冬青油浸 蜡用于组织块浸蜡的石蜡分为低溶点蜡和高溶点蜡。 低溶点蜡溶点在48-50，也称软蜡；高溶点蜡溶点 在60-62，也称硬蜡。因此，浸蜡的恒温箱相应地 分为软蜡箱和硬蜡箱两种：软蜡箱的温度控制在52 54之间，组织浸蜡时间一般可达24小时；硬蜡箱的 温度控制在62-64之间，组织浸蜡时间一般不超过 1小时。组织块浸蜡的成功与否与温度和时间有很大的 关系，温度愈高，时间愈长，则组织块的收缩愈大，脆 化愈明显 包 埋 组织浸蜡完成后，接着进行组织块包埋。用于包埋的 是硬蜡。使用前须在恒温箱中多次溶化，利用热胀冷缩的 原理挤出原石蜡里的空气，再加入一定数量的（约十分

13、之 一）蜂蜡（或旧蜡）相混合，提高石蜡的密度和粘度，以 使切片时便于形成完整的蜡带。蜂蜡也称黄蜡，是一种动 物蜡，溶点约在54，粘滞度比石蜡高。组织块包埋一般采用包埋框来进行，包埋框由两块“L” 型的金属框和一块金属底板相对拼合而成。包埋组织时应 注意将组织块的切面朝下放平，包埋镊应加温后使用。组 织包埋好后，应等石蜡凝固后才可将包埋框打开。修整蜡 块时，组织块应距蜡块边缘23毫米，以利于连续切片。 切 片 石蜡切片用石蜡作为包埋剂制作的切片称为石蜡切片，是组织切 片中应用最为广泛的一种切片，其优点是易于制作大量菲 薄的组织标本，而且石蜡包埋块又可长期保存。仪器及器材准备切片机 切片刀 恒温水

14、箱式摊片仪经过清洁处理的载玻片 眼科弯镊子中号羊毫毛笔 粘片剂 切片过程： 调节水温至47左右；固定蜡块；修整包埋面；调节切片厚度至46微米；切片；摊片；烤片。切片的注意事项： 切片前要将切片机各部位的螺丝旋紧，否则会引起切片机各部件震动，造成切片厚薄不匀。 块的切面和切片刀的倾斜度之间的夹角应按切片机刀台上的刻度作适当调整。 恒温水箱的温度应比包埋蜡的溶点低5-6。 环境温度高时蜡块容易变软。应使用冰块使蜡块的表面迅速冷却，以增加蜡块表面的硬度。骨切片骨组织作切片观察，必须将骨的钙质除去，仅保留软组 织才能切片，这一过程就是“脱钙” 。脱钙 将厚约23mm的骨片放入脱钙剂中2448小时脱钙剂

15、 ： 浓硝酸 5 ml 尿素 35g蒸馏水 100 ml脱钙后可按一般组织标本的脱水、透明、包埋、切片及染色 过程进行处理。骨髓切片、冰冻切片染料和染色 染料 是指分子中含有发色团和助色团的有机化合物，有 鲜艳的色彩，对于组织有极强的亲和力。根据来源可分为两类：天然染料（卡红、苏木精）人工合成染料（苦味酸、桔黄G）根据其化学性质分为：碱性染料(basic dye)酸性染料(acid dye)中性(neutrophilia)染料染色的原理 化学反应 在组织细胞内一般认为都含有酸性物质和碱性物质。染色时酸性物质与碱性染料中的阳离子结合，碱性物质与酸性染料中的阴离子结合。在细胞核中主要由酸性物质组成（如核酸等），所以与苏木精等碱性染料有很强的亲和力。细胞质主要由硷性物质组成，所以与伊红等酸性染料有很强的亲和力。能被碱性染料着色的物质称为嗜碱性(basophilia)物质，能被酸性染料着色的物质称为嗜酸性(acidophilia)物质。物理反应