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1、32008202201收稿,2008205209修稿;国家自然科学基金(基金号20774082 ,50703036)、 国家高技术研究发展计划(863计划,项目号2006AA03Z329 ,2006AA03Z444)、 浙江省科技计划项目(项目号2007C24008)和教育部 “新世纪优秀人才计划”(项目号NCET20520527)资助;33 通讯联系人,E2mail :jijian 研究简报一种仿细胞膜聚合物用于碳纳米管表面改性3徐方明 徐建平33计 剑33沈家骢(浙江大学高分子科学与工程学系 教育部高分子合成与功能构造重点实验室 杭州 310027)摘 要 以新型含有磷酸胆碱基的仿细胞膜
2、两亲聚合物 胆固醇封端的聚(22甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱) (CPMPC)为表面稳定剂实现碳纳米管的表面改性,利用两亲聚合物中的胆固醇疏水段与碳纳米管表面进行非共价键的稳定结合,通过两亲聚合物中聚(22甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱) (PMPC)亲水段实现其水溶性和生物相容性.并以商业可获得的典型两亲分子,末端为胆固醇的聚氧乙烯(CPEG)和卵磷脂,为对照进行研究.研究表明CPMPC和CPEG均具有比卵磷脂更高的对碳纳米管进行分散的能力.而CPMPC改性的碳纳米管比CPEG改性的碳纳米管具有更优的稳定性和生物相容性,通过新型仿细胞膜聚合物改性的碳纳米管在生物医用领域有潜在应用.关键词 碳纳米管
3、,磷酸胆碱,细胞膜仿生,生物相容性作为一种优异的纳米材料,碳纳米管在生物 传感器、 生物反应器、 热治疗、 药物传递和基因传 递等生物医学领域的潜在应用受到广泛关注.但 碳纳米管难以在水或有机溶剂中进行溶解和分散 的问题成为其在生物医学领域应用的主要技术障碍.在现有的解决其溶解性和分散性问题的种种 方法中,通过使用两亲分子对碳纳米管进行物理 分散的方法具有相当的优势.两亲分子的疏水段 和碳纳米管表面发生非共价键相互作用,实现两 亲分子在碳纳米管表面的结合,而亲水段则赋予 碳纳米管分散性和水溶性.物理分散的方法简便 易行1,而且在物理分散的过程中,碳纳米管的结 构和优异性能被充分保留2. 然而物
4、理分散方法中,用于分散碳纳米管的两亲分子一般本身具有潜在的毒性,成为限制这 种方法在生物医学领域应用的主要因素之一3. 最近的研究表明4,以胆固醇为疏水段,以仿细胞 膜结构的聚甲基丙烯酸磷酸胆碱酯为亲水段的两 亲性分子CPMPC所形成的胶束体系具有良好的生物相容性,能够有效地实现疏水性抗癌药物阿 霉素的包埋与释放. 胆固醇和磷酸胆碱类磷脂分子都是细胞膜的 重要组成部分,具有良好的生物相容性5.分子模 拟的结果表明胆固醇和碳纳米管表面具有较强的结合力6.此外,细胞膜外层带有等量正电荷和 负电荷的卵磷脂的极性磷酸胆碱基团可以与水分 子形成非常牢固的水合层7,人们已经采用卵磷 脂作为稳定剂实现了碳纳
5、米管在水溶液中的有效 分散8.进一步的研究表明,随两亲分子中的亲水 段分子量增加,其提供的空间排斥能力增强,因而 对碳纳米管的分散能力也增强9.因此,通过对两 亲分子的亲水段和疏水段进行合理的仿生设计, 成为解决常规物理分散方法中两亲分子的毒性和分散能力较低等问题的可能途径10. 本文选用以胆固醇为疏水段,以仿细胞膜磷 酸胆碱基聚合物为亲水段的两亲分子CPMPC ,并 以商业可获得的典型两亲分子,末端含胆固醇的 聚氧乙烯(CPEG)和卵磷脂为对照,通过紫外跟踪和细胞培养等手段,研究CPMPC用于改善碳纳 米管的水溶性、 稳定性和生物相容性的有效性.1 经过两亲分子改性的碳纳米管的制备 仿细胞膜
6、磷酸胆碱基两亲聚合物分子设计及 其制备参照文献11方法进行,两亲分子 2胆固醇2聚氧乙烯(CPEG)由Nihon Emulsion Co. Ltd.提 供,所用聚合物的基本性质见表1.卵磷脂购自上 海华东师范大学化工厂.荧光光谱在FP2770(Japan Spectroscopic)光谱仪上测定.碳纳米管购自深圳纳米港有限公司(多壁碳纳米管,直径40第10期 2008年10月高 分 子 学 报 ACTA POLY MERICA SINICANo.10 Oct. , 2008100660 nm)直接使用.称取一定量的碳纳米管加入到特定浓度的两亲分子水溶液,在K Q2200型超 声清洗器中进行超声
7、处理(100 W ,40 kHz)超声处 理30 s后,静置一定时间,取上层清液,便得到经 过两亲分子改性的碳纳米管的水溶液.Table 1 Properties of the amphiphilic polymersSampleMnCMCa(mgmL)CPMPC7917b2311810- 3CPEG2300c312410- 3aCalculated from the excitation spectra of pyrene as a function of polymerconcentrations in water ;bMolecular weight from the1H2NMR res
8、ults;cMolecular weight from supplier2 不同浓度两亲分子水溶液分散碳纳米管能力 测试 精确配制一系列不同浓度的两亲分子水溶 液.称取25 mg碳纳米管加入到3 mL上述溶液 中,超声处理30 s ,静置115 h ,取上清液稀释31倍后,在Shimadzu UV22055紫外光谱仪上测定600 纳米处的紫外吸收值.每个样本平行测定取平均 值.利用碳纳米管在600 nm处的吸收值与溶液中 碳纳米管浓度的线性定量关系12,对不同浓度的 两亲分子对碳纳米管分散能力进行比较研究,其结果见图1.结果表明,CPMPC和CPEG对碳纳米 管的分散能力随着聚合物溶液浓度的升
9、高而增 加,而且在相同浓度下,CPMPC溶液对碳纳米管 的分散能力略高于CPEG的分散能力,均显示出 比卵磷脂溶液具有更高的对碳纳米管的分散能力.进一步与标准曲线的对照实验表明,1 mgmL 的CPMPC水溶液可以有效分散碳纳米管的浓度 为11705 mgmL ,1 mgmL的CPEG的水溶液为11468 mgmL ,而卵磷脂水溶液最高的分散能力为01326 mgmL.说明具有较长磷酸胆碱基聚合物链 的CPMPC比单个磷酸胆碱基团的卵磷脂具有更 强的分散能力.3 聚合物水溶液分散碳纳米管的稳定性测试 称取15 mg碳纳米管加入到3 mL CPMPC和CPEG聚合物水溶液(2 mgmL) ,摇匀
10、后测定溶液在600 nm处的透光率在6 h内随时间的变化.经 过聚合物改性的碳纳米管在水溶液中的稳定性对 比见图2.由于溶液的透光率与分散在溶液中的 碳纳米管的浓度成反比,因此透光率的增大表明 碳纳米管在水溶液中的浓度降低.结果表明,经过CPEG改性的碳纳米管在水中沉降较快,在360min时透光率已经达到1110 %.而经过CPMPC改Fig.1 ComparisonofCNTssolubilityindifferentconcentrations of amphiphiles aqueous solution (a) CPMPC,(b) CPEGand (c) lecithin性的碳纳米管在
11、水中沉降缓慢,具有显著的稳定 性,在360 min时透光率仅为0157 %.这说明CPMPC改性的碳纳米管比CPEG改性的碳纳米管 在水溶液中的具有更好的稳定性.Fig. 2 Comparison of stability in aqueous solution between(a) CPMPC coated CNTs and (b) CPEGcoated CNTs4 经过聚合物改性的碳纳米管的细胞相容性评 价 将人脐静脉内皮细胞系HUVEC304的细胞悬 液种植到96孔聚苯乙烯培养板中,每孔8000个细胞,补 加Roswell Park Memorial Institute 1640 (RP
12、MI 1640)细胞培养液至180L ;在CO2体积分数为5 %的37 培养箱中培养24 h后,加入20L 经过聚合物分散的碳纳米管水溶液,控制碳纳米 管的浓度为30gmL ,聚合物浓度为100gmL , 在空白对照样品中加入培养液20L ,继续培养不 同时间后,参照文献4的方法测定细胞活性和观察细胞形态.细胞形态通过BIO2RAD2000激光共 聚焦显微镜进行观察.700110期徐方明等:新型仿细胞膜聚合物用于碳纳米管表面改性在控制培养基中碳纳米管的浓度为30gmL ,聚合物浓度为100gmL存在条件下,人脐内 皮细胞HUVEC304分别培养24 h、48 h和96 h后, 细胞活性检测结果
13、见图3.经CPEG改性的碳纳米 管存在条件下,培养24 h后细胞的活性已经降至4017 % ,并且随培养时间逐渐降低,培养48 h后细胞活性为2513 % ,而培养96后细胞的活性已经降 至717 % ,表明经CPEG改性的碳纳米管具有明显 的细胞毒性.而在仿生聚合物CPMPC改性的碳纳 米管存在条件下,细胞培养24 h、48 h和96 h细胞 后,其活性分别为9910 %、10019 %、9818 % ,显示出很小的细胞毒性.可见经过细胞膜仿生聚合物CPMPC改性的碳纳米管比经过CPEG改性的碳纳 米管具有更小的细胞毒性.Fig. 3 The cell viability of HUVEC3
14、04 incubated with (a)CPMPC coated CNTs and (b) CPEGcoated CNTs在将经过聚合物改性的碳纳米管加入培养基并继续培养后,通过荧光模式对细胞形态进行观 察的结果见图4.在CPEG改性碳纳米管存在条件 下,细胞经过培养24 h后,显示出圆形收缩状态, 而继续培养到96 h后,已经没有可观察到的细胞 存在. CPEG改性的碳纳米管在细胞培养过程中显现出细胞毒性的原因可能在于CPEG这种两亲分 子自身具有一定的细胞毒性4,在碳纳米管的分 散体系中,溶液中残存的未与碳纳米管结合的两 亲分子;而且通过两亲分子分散碳纳米管的方法 中,可能存在碳纳米管上
15、结合的两亲分子与溶液中残存的两亲分子的交换,这就会在增溶体系中 引入毒性.与此明显不同的是,CPMPC两亲分子 由于自身具有优异的生物相容性4,用于对碳纳 米管进行改性,细胞在所得碳纳米管分散体系中 经过24 h和96 h的培养后,其细胞形态均和自有培养基存在条件下的空白对照的细胞形态相近, 细胞呈铺展状态,数量较多,显示细胞呈正常的生 长状态.可见CPMPC改性碳纳米管的存在的不会 影响细胞正常生长. 细胞活性测定和细胞形貌观察的结果都表明,CPMPC改性碳纳米管具有良好的细胞相容 性.5 结论 对两亲分子的亲水段和疏水段进行合理的仿 生设计,是解决物理分散碳纳米管方法中存在的Fig. 4
16、Fluorescence micrographs of the HUVEC304 cells stained with FDA (a) incubated with CPEG coated CNTs for 24 h , (b) incubated withCPMPC coated CNTs for 24 h ,(c) incubated in pure culture media for 24 h , (d) incubated with CPEG coated CNTs for 96 h , (e) incubated withCPMPC coated CNTs for 96 h ,(f) incubated in pure culture media for 96 hAll the images were magnified 2002folds.8001高 分 子 学
