细胞生物学实验技术

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1、第二章第二章 细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术METHODS AND TECHNIQUES本章内容提要 第一节 显微技术 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、显微操作技术 第二节 生物化学与分子生物学技术 第三节 细胞分离技术 第四节 细胞培养与细胞杂交第一节 显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。、光学显微镜 1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。（一）普通光学显微镜Light Pathway of Microscope 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨力 R=

2、0.61/NA 其中为入射光线波长； NA为镜口率 sin/2； n=介质折射率； =镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。表一、几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin /2的最大值小于1；油镜介质为香柏油，镜口率可接近1.5； 普通光线的波长为400700nm，光镜分辨力约为0.2m，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。Fluorescence image, DNA in blue a

3、nd Microtubules in green 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光 观察、基因定位、疾病诊断。（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； 能显示细胞样品的立体结构； 分辨力是普通光学显微镜的3倍； 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laser confocal scanning microscope, LCSM激光共聚焦扫描 显微镜光路图LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytosk

4、eleton (green) and the nucleus (blue) http:/www.itg.uiuc.edu/（四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。 可观察 4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1. 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。2. 相位板（annular phas

5、eplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。（五）相差显微镜原理用途：观察未经染色的玻片标本。（六）偏光显微镜polarizing microscope 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。 光源前有偏振片（起偏器），进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器 （与起偏器方向垂直的偏振片）。 载物台可以旋转。淀粉（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC） 1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立

6、体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。（八）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒； 用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。 （九）当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体； 自动化与电子化。二、电子显微镜（一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比； 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成

7、； 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍； 用于观察超微结构（小于0.2m）。1. 原理表二、不同光线的波长TEM LIGHT PATHWAY透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRONMICROSCOPE，TEM2. 制样技术 1）超薄切片 超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。2）负染技术 用重金属盐(如磷钨 酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷 处铺了一层重金属 盐，而凸的出地方 没有染料沉积，从 而出现负染效果， 分辨力可达

8、1.5nm左右。Negative Stained Archaebacteria 3）冰冻蚀刻 freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。an onion root tip cell with no etching. 断面的三种处理方法： 蚀刻（ etching ）、不蚀刻（no etching ） 、深度蚀刻（deep etching ）培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示 Clathrin衣被 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构

9、； 分辨力为610nm，因人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。（二）扫描电子显微镜Scanning electron microscope（ SEM） 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。SEM LIGHT PATHWAY人类红细胞酵母人类精

10、子（三）扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope，STM 原理：根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.01nm。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。扫描隧道显微镜原理引自http:/www.iap.tuwien.ac.at STM image of a DNA moleculeSchematic dr

11、awing of AFM三、显微操作技术 micromanipulation technique 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。 显微操作仪转基因显微操作过程 第二节 生物化学与分子生物学技术一、细胞化学技术组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位

12、研究。（一）固定1. 物理固定：血膜空气干燥、冷冻干燥。2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。（二）显示方法1.金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2.Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。3.联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。4.脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。5.茚三酮反应：显示蛋白质。二、免疫细胞化学 i

13、mmunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 免疫荧光法（immunofluorescent technique）：如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根过氧化物酶。三、放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示

14、DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。四、分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 （一）原位杂交（in situ hybridization）。 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 （二）Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，

15、操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。六、PCR 技术 PCR即：polymerase chain reaction。 反应体系：样品DNA；引物（primer），约15-20个核苷酸；4种dNTP；Tag DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度7580，短时间在95下不失活。缓冲体系和Mg2+。 反应过程：变性：约90-95；复性：约60左右；延伸：70-75；

16、重复 “变性复性延伸” 过程20-30次循环。PCR原理第三节 细胞分离技术一、离心技术 是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。 （一）差速离心 Differential centrifugation 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 Low speedHigh speedD