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1、分类号华中农业大学硕士学位论文E l k l 在小鼠睾丸和卵巢中的表达规律密级R e g u l a ro fE l k lE x p r e s s i o ni nT e s t i sa n dO v a r yi nM i c e研究生：黄成竹学号：2 0 1 0 3 0 2 1 1 0 0 8 4指导教师：霍立军教授指导小组：杨利国教授霍立军教授霍且军驭仪张淑君教授熊家军副教授李翔副教授专业：特种经济动物饲养获得学位名称：农学硕士研究方向：实验动物学获得学位时间：2 0 1 3 年6 月华中农业大学动物科技学院二O 一三年六月华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文否如需保
2、密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导炳指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同2 r 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 碱雌名兹时| j哆阮伽弓年莎月夕日学位论文使用授权书并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位学位论文作者签髫多凄删导师签名：常季签名匿期h 多年多月? 目签名日期：山t 3 年6 月f
3、 j 7 日7jE l k l 在小鼠睾丸和卵巢中的表达规律目录摘要iA B S T R A C T i i i1 前言1日U 舌11 。1 睾丸的功能以及调控11 1 1 间质细胞的形态学及功能11 1 2 管状小隔室中各细胞功能11 2 附睾功能及调控21 2 1 附睾管的吸收分泌功能21 2 2 精子成熟、获能和储存31 2 3 维持射精时的内环境31 2 4M A P K 调节雄性动物繁殖性能41 3 卵泡发育和卵泡闭锁41 3 1 卵泡发育41 3 2 卵泡闭锁41 3 3 颗粒细胞对卵泡发育的调控51 4E l k l 家族及活性的调节51 4 1E l k l 概述51 4 3E
4、 l k 4 的活性受S U M O 化调节81 4 5S E N P l 调节E l k l 的活性92 研究目的和意义1 03 材料与方法1 13 1E l k l 真核表达载体构建1 13 1 1 材料、试剂1 13 1 2 培养基1 13 1 3 仪器1 23 1 4 方法1 23 2 小鼠颗粒细胞分离和培养1 7I华中农业大学2 0 1 3 届硕士研究生学位( 毕业) 论文3 2 1 试剂、溶液、实验动物1 73 2 2 仪器183 2 3 颗粒细胞分离和培养方法1 83 3 颗粒细胞转染1 93 3 1 试剂、溶液1 93 3 2 仪器1 93 3 3 转染方法1 93 4 细胞增
5、殖检测2 03 4 1 试剂2 03 4 2 仪器2 03 4 3 检测方法2 03 5 组织细胞总蛋白的提取2 03 5 1 材料、试剂2 03 5 2 组织蛋白的提取2 03 5 3 培养颗粒细胞总蛋白的提取2 13 5 4 卵泡总蛋白的提取2 13 6W e s t e r nB l o t 2 13 6 1 材料、试剂2 l3 6 2 溶液、缓冲液的配制2 23 6 3 仪器2 33 6 4 操作步骤2 43 ，7 免疫组织化学2 73 7 1 材料、试剂2 73 7 2 操作方法2 73 8 免疫荧光细胞化学2 93 8 1 材料、试剂2 93 8 2 操作方法2 93 9 统计学分
6、析3 04 结果与分析31I IE l k l 在小鼠睾丸和卵巢中的表达规律4 1 睾丸和附睾中的表达和定位规律研究3 14 1 1E l k l 在性成熟发育周期小鼠睾丸中的表达规律3 14 1 4E l k l 在小鼠附睾中的定位情况3 54 2E l k lm R N A 和蛋白在卵巢中的表达和定位规律研究3 74 2 1 特异性引物检N d , 鼠卵巢中E l k lm R N A 表达3 74 2 2 激素诱导超数排卵过程中E l k l 在卵巢中的表达规律3 74 3E l k l 在不同级别卵泡和颗粒细胞中的表达研究4 24 3 1 不同卵泡中E l k l 的表达差异4 24
7、3 2 不同卵泡颗粒细胞中E l k l 表达4 44 4E l k l 在颗粒细胞中的定位及作用研究4 54 4 1E l k l 真核表达载体的构建4 54 4 2 内源性的E l k l 及外源性的E l k l 在小鼠颗粒细胞中的定位4 64 4 3 过表达E l k l 可以促进颗粒细胞的增殖4 75 讨论4 85 1E l k l 在小鼠睾丸和附睾中的表达调控4 85 2E l k l 在小鼠卵巢颗粒细胞和卵泡的调控5 06 结论5 2参考文献5 3致谢6 11 1 |E l k l 在小鼠睾丸和卵巢中的表达规律摘要雄性哺乳动物精子的发生、成熟是一个非常复杂的过程，精细胞需要经过变
8、态发育而成熟，研究发现许多基因参与这一生理过程；雌性哺乳动物卵泡发育和闭锁是决定配子发育成熟的关键因素。E l k l 是M A P K 级联反应的作用底物，M A P K 级联反应可以磷酸化E l k l ，进而激活c f o s 的启动子，参与调控细胞的增殖与分化过程；同时有研究报道，E l k l 对细胞的凋亡有一定的调节作用。本课题研究E l k l 在雄性小鼠和雌性小鼠性成熟过程中的表达规律，以探究其对精子发生和卵泡发育的作用。同时，在小鼠颗粒细胞中研究过表达E l k l 对颗粒细胞增殖凋亡的影响，推测E l k l对卵泡发育、卵泡闭锁的调控机制。实验设计和结果如下：本课题以不同发
9、育时期( 周龄) 小鼠睾丸和附睾石蜡切片为实验材料，检测E l k l的定位和表达，揭示E l k l 在雄性小鼠性成熟过程中的空间和时间表达模式。通过激素( P M S G ，H C G ) 处理不同时间的卵巢，利用免疫组织化学法研究不同发育阶段卵泡中E l k l 的表达定位规律，揭示E l k l 在卵泡发育中的作用。应用颗粒细胞体外培养模式，检测E l k l 在颗粒细胞中的定位模式，以及过表达后对颗粒细胞增殖水平的影响。实验结果说明：( 1 ) E l k l 在不同周龄的小鼠睾丸以及附睾中的表达存在差异。w e s t e r n b l o t 结果说明，小鼠性成熟前E l k l 在睾丸中的表达较高，并且主要在曲细精管的精原细胞中表达，性成熟后表达量较低，在精子细胞中也有表达；在附睾中的表达随着小鼠周龄的增加呈递增趋势。E l k l 的表达与精子的发生、成熟过程有一定的关联，在精原细胞中一直有较高水平定位，暗示其可能在精原细胞的进一步分化和自我维持中发挥作用，而在精子细胞及精子形成过程中表达暗示其可能也在此期间发挥作用。( 2 ) 激素处理小鼠卵巢，发现在诱导排卵的过程中，P M S G 能降低卵巢中E l k l 的表达量，差异不显著( P 0 0 5 )
