免疫化学技术

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1、酶联免疫吸附反应 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA) 免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞 争 法双抗原夹心法间 接 法双位一点法什么是 酶联免疫分析技术ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例一、基本原理是利用抗原抗体进行的检测技术。 即利用制备好的特异抗原或抗体作为试 剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）ELISA原理使

2、抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其 免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直 接相关 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗 体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、 电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶 标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。二、酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特

3、异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.酶 底 物显显色反应应 测测定波长长 辣根过过氧化物酶 邻邻苯二胺 四甲替联联苯胺 氨基水杨杨酸 邻联邻联 苯甲胺 2,2-连连胺基-2(3-乙基-并噻噻唑唑啉磺酸-6)铵盐铵盐 橘红红色 黄色 棕色 兰兰色 蓝绿蓝绿 色492 460 449 425 642碱性磷酸酯酯酶 4-硝基酚磷酸盐盐(PNP) 萘萘酚-AS-Mx磷酸盐盐+重氮盐盐 黄色 红红色 400 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色 深蓝蓝色 405 420 -半乳糖苷酶

4、甲基伞酮伞酮 基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧荧光黄色 360,450420 ELISA的种类和变化 （一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA （一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。4.酶催化底物并显色。获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相 载体连接形

5、成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成 固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体待测抗原酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定双抗体夹心法测抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体 ，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法 。（1）双抗体夹心法测定抗原A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗

6、体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 双抗原夹心法（抗-HBs等）示意图1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。4.酶催化底物并显色。酶抗原酶标记抗原抗体抗原固相载体双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。间接法是检测抗体最常用 的方法，其原理 为利用酶标记的 抗抗体以检

7、测已 与固相结合的受 检抗体，故称为 间接法。（二）间接法酶抗抗 体酶标记 抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结 合为抗原-抗体-酶标记抗抗体 复合物。 4.酶催化底物并显色。间接法（抗-HCV等）示意图间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体 加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体 加底物 显

8、色 根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定（三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。用已知特异性 抗体包被 固相载体 测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合 分别洗涤 除去未结合 的成分 加底物显色分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量（3）竞争法测定抗原A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶 标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分

9、结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。 放射免疫测定法 (Radioimmunoassaly,RIA) 应用同位素标记技术来检测抗原抗体反应 的高灵敏度方法。 此法兼有放射性同位素标记物所显示的高 灵敏度（可达到 ng和pg水平）和血清学反 应的高特异性优点。发光免疫测定法(Luminescent immunoassay) 将化学发光反应与免疫测定法结合起来的 新型技术。 常用的发光试剂有鲁米诺（luminol)和光泽 精(luc

10、igenin)。一：灵敏性该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众 所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱 导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象 。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或 抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其 进行定量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学 比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感 度约为510g/ml 。 ELISA的特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗

11、体反应具有高度的特异性。ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液ELISA的试剂准备A 固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板

12、各孔之 间性能相近。包被的方式将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体 的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因 此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的 DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原 物质的定量测定。脂

13、类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如 乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷 风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复 性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。包被用抗体IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于

14、抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。包被的条件pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。封 闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的

15、蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封闭？洗涤液在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。ELISA的试剂准备B 结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂1 酶的催化活性2 抗体（或抗原）的免疫活性3 含有或少含有游离的抗体（或抗原）4 结合物尚要有良好的稳定性。p 结合物用的抗原和抗体制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结

16、合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。p 酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定， 来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保 存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷 酶和脲酶等。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000， 是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素 ）结合而成，是一种卟啉蛋白质。p 结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过 碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使 酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%- 70%）和重复性好。交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。 （2）过碘酸氧化法：适用含糖