啤酒酿造过程中酵母菌株的生长监测

《啤酒酿造过程中酵母菌株的生长监测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《啤酒酿造过程中酵母菌株的生长监测（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、A p p l i c a t i o n N o t e47微 生 物 检 测Paul Held Ph.D., Principal Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc., 关键词：酵母生长 ，动力学分析 ，啤酒酿造啤酒酿造过程中酵母菌株的生长监测啤酒酿造过程中酵母菌株的生长监测 发酵用酵母菌株在多数食品工业领域扮演着重要的角色，比如啤酒、面包和红酒。啤酒或红酒在发酵过程中，酵母将糖、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸和其他复合物转换为酒精、二氧化碳以及饮料所需要的独特风味。为了能够得到稳定而理想的产量，并保持口味的稳定，就必须

2、严格控制生产原料和整个发酵过程中酵母菌株的生长。同理，新菌株的研发也需要监控其在不同条件下的生长情况。本文介绍了使用SynergyTM H1 全功能微孔板检测仪，在 96 孔板内进行温度控制、液体振荡、和菌株生长监控的完整流程。介绍酵母是一种单细胞真核菌类有机体，可以通过出芽或分裂进行无性繁殖（图 1）。然而酵母可以改变自身大小，常规酵母的直径为 3-8M 酵母是科学研究中最常使用菌种，烘培及发酵也几乎成了酵母的代名词。图 1. 酵母酵母已经有上千年的使用历史，被用于酿酒。法老墓的壁画中向我们展示了古代埃及人如何使用酵母酿造酒类饮料。同时面包的诞生也向我们阐释了酵母具有至少 5000 年的使用

3、历史1。直到 18 世纪，生物学家才得以揭示酵母的发酵特性可以将糖类发酵成为酒精， 同时产生二氧化碳。 也就是从那时起，烘培师，科学家和发酵工业开始研发特定需求的酵母菌株。酵母的生长阶段：用于酿造啤酒的酵母， 其生长过程固定， 可以被分为4个阶段：(1) 缓慢期 ; (2) 指数期；(3) 减速期；和 (4) 稳定期。在缓慢期基本没有新的酵母生长发生， 此时酵母处在环境适应阶段。随后的指数期，细胞迅速增长并分裂，养料与细胞数目极度相关。废物被稀释后其含量可以忽略。在这一期酵母的生长遵循第一动力学曲线。随着酵母数量的增加，细胞的生长速度开始减慢，随着一些参数 ( 如饱和废物量 ) 的变化，饱和效

4、应开始明显，最终酵母生长达到稳定期，由于高废料浓度和底物的完全消耗，已经不能监测到细胞的生长 ( 图 2)。图 2. 典型的酵母生长曲线，酵母培养于 YPD 培养基中，30C，12 小时，每 2分钟观测一次。芽殖酵母的分裂特性，可以让我们从大量的酵母突变体中筛选到表达我们所需要特性的克隆。每一个突变体都分裂自原始的第一代酵母。为了选到具有特定属性的酵母克隆，一种办法就是在特定的环境下，对酵母的生长进行监控。本文采用 SynergyTM H1 多功能微孔板监测仪，保证在稳定的温度环境下，提供持续的轨道振荡，同时采用吸收光测定来监控酵母在不同环境条件下的生长。材料和方法YPD 培养基粉，氯化钠，单

5、价和二价磷酸盐，乙醇购自Sigma- Aldrich (St. Louis MO)。 YPD 培养基按照说明书进行制备，并高压灭菌。消毒的平底透明微孔板，货号 3598购自 Corning (Corning, NY)。 透明的 TopSeal-A 封板膜，货号 6005185，购自 PerkinElmer (Boston, MA)。 不同的酵母菌株购自 Wyeast Laboratories (Odell, OR)。所有实验采用相同的处理流程。过夜培养的母液 (50mL) 种植于 250mL的 Erlenmeyer 管中，30C 培养，125RPM 轨道振荡。在培养实验前，取 150L 过夜培

6、养的母液，稀释于 7.5mL 的新鲜 1YPD 培养基中。稀释后的酵母细胞，按照需要种植于Corning 3598 平底透明板中。采用持续轨道振荡模式每隔 2A p p l i c a t i o n N o t e48分钟监测一次。振荡速度设定为慢速，振荡频率设定为559 (1mm 振幅 )。温度控制设置为 30C。细胞生长通过OD600nm 的吸收光散射来测定2。每孔的吸收光监测数据通过 SnergyH1 多功能微孔板检测仪 ( BioTek Instruments, Winooski, VT ) 的动力学模式进行采集。该检测仪通过Gen5TM仪器控制和数据分析软件进行仪器控制和数据分析（

7、BioTek Instruments, Winooski, VT）。结果细胞数目效应Budvar2000 淡啤酒酵母过夜培养，然后根据需要使用 YPD培养基稀释。稀释后的样品 (200 L/ 孔 )，加入微孔板中，并采用 8 次重复。对每孔进行 600nm 吸光度的跟踪监测。吸收光监测数据显示随着细胞数目的增加，吸光度也随之增加（图3）。由于细胞在溶液中成悬浮状态，检测结果其实主要反应的是光的散射而非真正的吸收光，因此结果并不遵循琅勃比尔定律，也并不必要呈现线性。所得到的数据适合二次方程分析。图 3.Budvar 2000 淡啤酒酵母菌株的吸光图。生长均一性整板酵母生长的重复性检测是比较研究中

8、所必须的步骤。当单一克隆来源的 Budvar 2000 淡啤酒酵母被种植于 96 孔板的所有孔内，每孔的生长模式均一致（图 4）。如前所述，过夜培养的母液，采用 YPD 培养基稀释后，在 96 孔中每孔加入 200 L 稀释菌液。所有培养样品在 600nm 下的平均吸光度为 0.156，CV 值为 2.6%。菌液培养 20 小时后，板内平均吸光值为 1.516，CV 值为 1.5%。不同行与列孔间实验前后的吸光值相似。图 4. 动力学吸收光模式监测 Budvar2000 淡啤酒菌株生长。当对不同孔的细节进行详细比较时， 可以观测到微小的不同。这些细微的不同，不仅仅在实验初始和结束时能观测到，也

9、可以在实验期间的数据点中观测到（图 5）。所有孔平均的log 相生长速率是 3.68mOD/min，CV 值是 2.48%。该数据意味着不同实验条件下的 log 相生长速率可以做为相互比较的参数。图 5. 不同孔中酵母细胞生长比较。30C 所有 96 孔中 Budvar2000 淡啤酒酵母动力学吸收光监测数据图。温度敏感性温度条件是酵母生长的一个重要指标。我们监测 4 种不同酿酒酵母菌株的生长情况，将过夜培养的酵母菌株原液稀释后种植于 96 孔板中，每个样品做 22 次重复，并做 8 个对照孔，对照孔内为 YPD 培养基。同样样品分布的板共六块，并在不同检测仪的特定温度下进行动力学分析。如图

10、6 所示，Budvar 淡啤酒酵母在室温至 37C 之间没有明显生长变化。当达到 40C 时，缓慢期轻微延伸，但是更重要的是指数期的生长速率下降，静止期的细胞数目比低温时观测到的少。当培养温度达到 45C 时 ( 如图 6 )，几乎观测不到酵母细胞的生长。其他 3 种酵母菌株所观测到的情况也相同（数据没有显示）。微 生 物 检 测A p p l i c a t i o n N o t e49微 生 物 检 测图6. Budvar淡啤酒2000酵母的温度生长效应。 酵母在相应的温度下生长平行。当我们将四种酵母限定在指数期，可以比较不同菌株的温度耐受性。在指数期观测生长速率，绘制每一点的吸光值，可

11、以发现不同菌株的温度耐受和生长速率有明显不同（图 7）。当测定吸光值改变时，两种淡啤酒菌株在 37C 以下生长速度最快。两种浓啤酒菌株（1098 和 1469）在相应温度下显示较慢的生长速率，以及与其他菌株相比，对温度升高耐受性较低。图 7. 温度对指数生长期生长速率的影响。乙醇耐受酵母在有糖类存在下进行发酵产生乙醇和二氧化碳。当废物的量变得明显增加时，这些废物的存在则影响酵母细胞的增长。过夜培养四种不同的酿酒酵母菌株，每种菌株被稀释后150L 培养于 96 孔板中，每个菌株进行 22 个重复。每孔中再加入 50L 乙醇 /YPD 不同配比的混合液，每种配比条件重复两次。当进行乙醇影响检测时，

12、发现高浓度乙醇可以影响酵母的生长。以 UrqueII2001 淡啤酒酵母生长为例，酵母所能耐受的乙醇浓度为 2.5或更低。高于此浓度水平酵母菌株的生长明显降低。如图 8 所示。在指数生长期，其他酵母菌株也观测到了相同的生长速率。在进行测试的几种菌株中，Budvar2000 表现出最好的耐受性，当乙醇浓度达到 5% 之前，都没有显示生长下降。British 淡啤酒酵母可以耐受 2.5的乙醇，而其他两种菌株的生长随着乙醇的浓度增加而显示生长抑制。( 图 9 )图 8. UrqueII2001 淡啤酒酵母生长曲线的乙醇效应。图 9 自动分析性能数据 PH 敏感性为了测试 PH 值对酵母生长的影响，四

13、种不同的啤酒酵母进行过夜培养，将 150L 培养于 96 孔板中，并做 22 个重复。每孔再加入50L 50mM的磷酸盐， PH范围在4.5至9.5之间，每种菌株在不同PH条件下， 做两个重复。 与碱性环境相比较，酵母更喜欢在酸性环境下生长。对 1469 Timothy Taylor 淡啤酒酵母的生长检测， 充分支持了酵母对酸性环境的生长偏好。在 PH 水平在 4.5 至 6.0 之间时，酵母的生长和正常条件下酵母细胞的生长，基本没有区别。( 图 10 ) 当 PH 值达到 6.5 时，细胞生长缓慢，但可以达到静止期的细胞浓度，不过该过程需要 3-4 个小时。当 PH 值达到 7.0 或更高水

14、平时，酵母细胞的生长速率和浓度均明显下降。图 7. 温度对指数生长期生长速率的影响。A p p l i c a t i o n N o t e50微 生 物 检 测乙醇耐受酵母在有糖类存在下进行发酵产生乙醇和二氧化碳。当废物的量变得明显增加时，这些废物的存在则影响酵母细胞的增长。过夜培养四种不同的酿酒酵母菌株，每种菌株被稀释后150L 培养于 96 孔板中，每个菌株进行 22 个重复。每孔中再加入 50L 乙醇 /YPD 不同配比的混合液，每种配比条件重复两次。当进行乙醇影响检测时，发现高浓度乙醇可以影响酵母的生长。以 UrqueII2001 淡啤酒酵母生长为例，酵母所能耐受的乙醇浓度为 2.

15、5或更低。高于此浓度水平酵母菌株的生长明显降低。如图 8 所示。图 8. UrqueII2001 淡啤酒酵母生长曲线的乙醇效应。在指数生长期，其他酵母菌株也观测到了相同的生长速率。在进行测试的几种菌株中， Budvar2000表现出最好的耐受性，当乙醇浓度达到 5% 之前，都没有显示生长下降。British 淡啤酒酵母可以耐受 2.5的乙醇，而其他两种菌株的生长随着乙醇的浓度增加而显示生长抑制。( 图 9 )图 9 自动分析性能数据 PH 敏感性为了测试 PH 值对酵母生长的影响，四种不同的啤酒酵母进行过夜培养，将 150L 培养于 96 孔板中，并做 22 个重复。每孔再加入50L 50mM

16、的磷酸盐， PH范围在4.5至9.5之间，每种菌株在不同PH条件下， 做两个重复。 与碱性环境相比较，酵母更喜欢在酸性环境下生长。对 1469 Timothy Taylor 淡啤酒酵母的生长检测， 充分支持了酵母对酸性环境的生长偏好。在 PH 水平在 4.5 至 6.0 之间时，酵母的生长和正常条件下酵母细胞的生长，基本没有区别。( 图 10 ) 当 PH 值达到 6.5 时，细胞生长缓慢，但可以达到静止期的细胞浓度，不过该过程需要 3-4 个小时。当 PH 值达到 7.0 或更高水平时，酵母细胞的生长速率和浓度均明显下降。图 10. PH 对 1469 TimothyTaylor 淡啤酒酵母生长的影响当检测其他酵母菌株时，结果有所不同。2001 和 1098 菌株显示和 1469 相同的生长模式。而 2000 则显示在偏碱性 PH值环境中生长率增加。( 图 11) 有趣的是四