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1、华中科技大学博士学位论文灯盏花素药代动力学及其对脑缺血神经元凋亡作用的研究姓名：刘奕明申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：曾繁典2003.5.1华中科技大学同济医学院博士学位论文灯盏花素药代动力学及其对脑缺血神经元凋亡作用的研究摘要厂 L 灯盏花素是从菊科植物短葶飞蓬中分离得到的黄酮类有效成分，临床主要治疗闭塞性脑血管病及其后遗症，疗效显著。此外，灯盏花素还用于高粘滞血症、静脉炎、支气管炎的治疗并辅助用于治疗糖尿病等疾病，其临床应用价值还在进一步拓展，应用前景广阔。因此有必要根据其药动学特点，优化制定最佳给药方案，使该药的临床使用更加安全、合理、有效。但其药动学研究甚少，且未见报道。为此本
2、研究建立了相关血浓测定方法，考察灯盏花素在动物体内的药动学规律：另外，为提高灯盏花素经消化道用药的绝对生物利用度，本文在灯盏花素磷脂复合物新制剂的研究方面作了一些初步探索性工作。研究表明，细胞凋亡参与了缺血后梗死灶的发展，是脑缺血神经细胞死亡、 的重要途径之一，在脑缺血的治疗中具有重要意义。因心本实验采用实验性脑 缺血再灌注模型，研究灯盏花素对脑缺血神经细胞凋亡的作用，为阐明灯盏花素的脑保护作用机制和为临床缺血性脑血管病的防治提供理论依据。第一部分灯盏花素的药物代谢动力学研究厂 【灯盏花素的主要有效成分是灯盏乙素( s c u t e l l a r i n ) ，它也是其中含量最高的成分。为
3、探讨灯盏花素的体内药动学规律，我们采用血药浓度法，选择灯盏乙素为检测标志物。目前灯盏乙素的血浆浓度测定方法及灯盏花素的药代动力学研究尚未见具体报道。本实验首次建立了快速、灵敏的固相萃取一高效液相色谱( S P E H P L C ) 法，对血浆灯盏乙素浓度进行测定。采用己建立的S P E H P L C法对灯盏花素在小鼠和家兔经静脉注射和灌胃后的体内过程进行研究，并对灯盏花素磷脂复合物新制剂的研究作初步探索。竺主型苎奎堂旦堕垦兰堕第一节血浆灯盏乙素浓度测定方法的建立博士学位论文本实验旨在建立测定灯盏乙素血浆浓度的固相萃取高效液相色谱( S P E H P L C ) 法。采用甲醇一水磷酸( 5
4、 0 ：5 0 ：0 5 ，v ：v i v ) 为流动相，N u c l e o s i lC 1 8 色谱柱( 2 5 0 m m x 4 6 m m ) 为固定相，紫外检测波长3 3 5 n m ，外标法定量。血浆样品的预处理采用固相萃取法。在此条件下，血浆样品在0 0 2 1 0 0p g m L 。1 浓度范围内线性关系良好，绝对回收率为8 0 2 2 7 0 3 ，相对回收率为9 7 7 0 1 5 8 ；精密度试验的日内、日间相对标准差( R S D ) 均小于1 0 ；灯盏乙素的保留时间为7 1 9m i n ，且不受血浆中其它杂质的干扰。本法简便、快速、准确、灵敏、选择性强，
5、适用于血浆灯盏乙素浓度的测定及其药代动力学研究。第二节灯盏花素小鼠体内药物动力学研究采用S P E - H P L C 法，测定小鼠静脉注射灯盏花素5 0m g k 昏1 和灌胃1 5 0m gk 9 1 后灯盏乙素的血药浓度，并计算药代动力学参数。结果小鼠i v 灯盏花素后，血药浓度迅速下降，0 7 5 1 5h 下降变慢，2h 时略有升高，随后进入消除相，血浓- 时间变化符合三房室开放模型，A U C 、C o 和T v 2 1 3 分别为1 2 9 7 1 t g m L - 1h 、1 3 2 2 3g g m L l 和4 0 4 h 。灌胃应用时，药物吸收很快，药后2 m i n
6、即可检测到药物，但血浓低，5m i n 时出现一较低吸收峰，而后血浓下降，3h 时血药浓度明显升高，并在4 h 达到峰值，药时曲线变化不甚规则；采用非房室模型法计算A U C 为1 9 6 6 9 9 m E - 1 h ，T 1 ，2 为3 4 h 。该药的绝对生物利用度仅为5 0 5 。第三节灯盏花素家兔体内药物动力学研究本实验以家兔为研究对象，采用S P E H P L C 法，测定经静脉注射灯盏花素低、中、高三个剂量后的灯盏乙素血药浓度时间曲线，并计算药动学参数。结果发现，家兔i v 灯盏花素后，血药浓度初期下降很快，表明药物在体内快速分布，其后衰减缓慢。采用3 P 8 7 程序处理血
7、浓数据得出血浆浓度变化均符合三房室模型，三种剂量的A U C 分别为( 4 6 6 _ + 0 8 7 ) ，( 1 0 1 3 _ + 1 7 7 ) 和( 3 7 0 5 _ + 3 6 0 )I x g m L “ 1 h ；C o 分 l J 蔓3 ( 5 4 0 3 _ + 9 1 5 ) ，( 1 1 9 4 8 _ + 1 1 2 8 ) 和( 2 8 5 0 7 + 4 0 3 6 ) p g m L l ；2竺! 型垫盔堂堕堕墨堂堕量圭兰竺丝苎T 1 ，2 p 分别为( 4 7 2 + _ 0 7 3 ) ，( 4 8 3 + _ 1 9 3 ) 和( 5 2 6 + _ 2
8、 9 4 ) h 。经统计学分析，当剂量为1 0 0 和2 0 0m g k 菩1 时，C o D 、A U C D 、T 1 倒、T ，2 、T 1 ，2 p 、C L s 、M R T 等主要药物动力学参数十分接近，无显著性差异，且c 。和A U C 随给药剂量的增加成比例增加，表明在此剂量范围内灯盏乙素的消除呈线性动力学过程。当剂量为4 0m g k 分1 时，各主要药动学参数与低、中剂量相比具有显著性差异( P 3 2 0 ”C( 1 9 5 2 0 05 C 变色) ，用前以生瑗盐水为溶稍，5 氢氧化钢溶液调p H = 6 5 至完全溶解。灯盏乙素对照品：购自中图药品嫩物制品检定所，
9、纯度 9 8 ，用前以甲浆溶籍。甲醇：色谱纯，邯郸四友嫩物医学技术有限公司。磷羧：分橇缝，武汉纯学试麓厂。水：高纯水，去离子水经石英亚沸重蒸。1 2 仪器高效液相色谱仪：翻本岛浮公司，包括L C 1 0 A D 裂，S P D I O A 紫外检测器，C T O 1 0 A S 柱温箱。1 6华中科技大学同济医学院博士学位论文N 2 0 0 0 色谱工作站：浙江医科大学研制。D L 一1 型固相萃取器：中国科学院大连化学物理研究所。S P E 柱：C 1 8 ，2 0 0m g ，2 5m L ，中科院大连化物所。A E 2 0 0 型电子天平：瑞士M E T r L E R 。K Q 一2
10、5 0 B 型超声波清洗器：昆山市超声波仪器厂。5 5 0 型石英亚沸高纯水蒸馏器：江苏石英蒸馏器厂。L D R 4 8 4 C 高速冷冻离心机：北京医用离心机厂。Y K H I I 型液体快速混合器：江西医疗机械厂。2 方法2 1 色谱条件N u c l e o s i lC a s 柱：2 5 0m m x 4 6i n n l ，5 1 x m ，德国M a c h e r y N a g e l 公司。流动相：甲醇一水一磷酸( 5 0 ：5 0 ：0 5 ，v ：v ：v ) ，0 4 5 m 减压抽滤，超声脱气1 5 m i n 。流速：1 0m L m i n 。；柱温：3 8 “
11、 C ；检测波长：3 3 5n l n ，O 0 1 A U F S 。2 2 血浆样品预处理采用D L 1 型固相萃取器为固相萃取辅助装置。将S P E 柱先后用1 0 m L 甲醇和1 0m L 水活化。取血浆O 5m L ，加入0 5 磷酸溶液1m L ，旋涡混合1r a i n ，离心。将混合液移入已活化的S P E 柱，减压使混合液恒速通过S P E 柱。然后分别用2m L 水和0 2m L 甲醇清洗小柱，最后用甲醇1 5m L 洗脱。收集洗脱液，4 0 。C 水浴，N 2 中吹干。残留物用流动相2 0 0 皿充分溶解后，取2 0 此进样，进行H P L C 分析。2 3 方法学考察
12、【4 删2 3 1 标准曲线的制备取空白血浆0 5 m L 置于离心管，加入灯盏乙素标准液，配制成终浓度分别为O 0 2 ，0 1 ，0 5 ，1 0 ，2 5 ，5 0 和1 0 0 “g m L l 的血浆标准系列，按“2 2血浆样品预处理”项下操作，每个浓度重复5 管。以血药浓度C 对测得的峰面1 7华中科技大学同济医学院博士学位论文积A 做线性回归，得到标准直线方程。2 3 2 回收率试验绝对回收率( 萃取回收率) ：配制浓度为0 0 5 ，2 5 和2 5 O 嵋m L l 的灯盏乙素标准液，进样2 0 血( 分别含乙素1 ，5 0 ，5 0 0n g ) ，每个浓度重复5 次，取其
13、平均值作为对照峰面积；配制浓度为0 0 2 ，1 0 和1 0 0g g m L l 的标准血浆样品，按“2 2 血浆样品预处理”项下操作，每个浓度5 个样品重复测定5 次，将所得的峰面积与对照峰面积值比较得绝对回收率。相对回收率( 方法回收率) ：取空白血浆O 5m L ，准确加入灯盏乙素标准液，制得低、中、高三个浓度( O 0 2 ，1 0 和1 0 0 雌m L l ) 的标准血样，按“2 2血浆样品预处理”项下操作，每个浓度5 个样品重复测定5 次。将测定的峰面积由标准曲线计算出药物的检出浓度，其与加入浓度的比值即为相对回收率。2 3 - 3 精密度试验配制低、中、高三个浓度( O 0
14、 2 ，1 0 和1 0 0p g m L l ) 的标准血样，按“2 2血浆样品预处理”项下操作，每个浓度5 个样品同日内重复测定5 次，得到日内精密度：每个浓度5 个样品每天测定一次，连续测定5 天，得到日问精密度。2 3 4 方法的特异性按上述方法测定，标准血浆样品中所测标志物保留时间为7 1 9 m i n ，与灯盏乙素对照品的保留时间为7 1 9 m i n 一致，且不受血浆中内源性杂质的干扰。2 3 5 灵敏度( 最低定量限)它是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低可检测的药物浓度。本法为0 0 2g g m L l 。结果在上述色谱条件下，血浆样品在
15、0 0 2 1 0 0g g m L “ 1 浓度范围内线性关系良好，直线方程为C = 8 9 6 1 1X1 0 6 A + O 0 0 2 9O = 5 ) ，相关系数r = 0 9 9 9 9 ( F i g 1 2 ) ；绝对回收率为8 0 2 2z7 0 3 ( T a b 1 1 ) ，相对回收率为9 7 7 0 1 5 8 ( T a b 1 2 ) ：1 8华中科技大学同济医学院博士学位论文精密度试验的日内、日间相对标准差( R S D ) 均小于1 0 ( T a b 1 3 ) ；最低检测限0 0 2P g - m U l ；色谱图见F i g 1 3 ，灯盏乙素的保留时间
16、( t R ) 为7 1 9m i n ，且不受血浆中其它杂质的干扰。本研究建立的S P E H P L c 分析方法，简便、快速、准确、灵敏、选择性强，适用于灯盏乙素血浆药物浓度的测定及其药代动力学研究。讨论中药药物代谢动力学研究方法大体可分为两大类：血药浓度法和生物效应法。血药浓度法与化学药物的药动学研究原理、方法相似，通过测定中药复方已知成分在体液中的浓度，计算各种药动学参数，以其为代表研究中药复方药动学。该类方法简便、快速、灵敏度高、专属性强、重现性好，因此采用本法研究中药药动学的报道较多【9 l o 灯盏乙素是灯盏花素的主要有效成分，并且其含量超过9 0 ，因此本试验以灯盏乙素为标志物，建立血浆灯盏乙素浓度测定的方法，为
