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1、中国医科大学博士学位论文凋亡抑制基因Survivin在非小细胞肺癌中的表达及其与P53、 bcl-2、增殖、凋亡相关性研究姓名：丛德刚申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：胡永校2003.4.1中文摘要背景和目的肺癌是严重危害人类生命和健康的常见病，目前国内外肺癌的发病率 和死亡率呈逐年上升趋势。在我国城市中，肺癌的死亡率已成为恶性肿瘤之首。尽管联合应用手术、放疗、化疗、生物治疗等各种手段，肺癌患者的预后并无明显改善，原因在于肺癌的发生发展是多基因改变、多阶段的复杂过程。因此，深入研究肺癌分子生物学特征，对肺癌的早期诊断、治疗及改善预后具有重要意义。恶性肿瘤是细胞遗传突变所致的一类分子疾病，
2、其主要特征之一是失控性细胞增殖。近几十年来围绕细胞增殖的分子调控机制研究取得重大突破，证明癌基因活化和( 或) 抑癌基因失活是肿瘤发生与发展的一个重要因素。然而进一步研究发现，某些类型的癌基因和抑癌基因的主要作用是阻 止细胞的正常死亡，从而揭示，肿瘤细胞内死亡调控机制失常也与肿瘤的形成密切相关。于是，细胞凋亡与癌变的关系引起人们的广泛注意，成为目前 分子细胞生物学一个新的研究热点。细胞凋亡是机体重要的生理过程，起着维持内环境稳定的关键作用。凋亡调节紊乱有助于细胞的恶性转化和肿瘤的进展。是恶性肿瘤形成的重要机制之一。凋亡抑制蛋白( i n h i b i t o ro fa p o p t o
3、s i sp r o t e i n ，I A P ) 是抑制细胞凋亡的重要成分。S u r v i v i n 是新近发现的一种I A P 家族成员之一，其组织分布具有明显的细胞选择性，与另一凋亡抑制基因b c l 一2 的分布显著不同，在正常成人已分化的组织( 胸腺、生殖腺除外) 不表达，而在多种肿瘤组织中表达，且 S u r v i v i n 的表达与患者的预后密切相关。S u r v i v i n 的表达还与细胞增殖有关。目前关于S u r v i v i n 在肺癌中表达的报道甚少，其与临床病理特征的关系尚无公认的结论。肺癌组织中S u r v i v i n 基因表达与细胞增殖
4、、凋亡关系的研究尚未见报道。为此，我们采用逆转录聚合酶链反应( r e v e = et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T P C R ) 方法检测了4 3 例肺癌组织、1 0例良性瘤病变和4 3 例病灶旁正常肺组织中S u r v i v i nm R N A 的表达，采用免疫组织化学方法检测了4 3 例肺癌组织和配对的病灶旁正常肺组织中S u r ，v i v i n 蛋白及P 5 3 、b c l 一2 蛋白的表达，并探讨其与临床病理特征及P 5 3 、b c l一2 之间的关
5、系。我们还应用流式细胞术，对肺癌细胞的增殖活性和凋亡水平进行检测分析，期望证明在肿瘤细胞系研究中得出的结论，即S u r v i v i n表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关。材料与方法一、实验材料标本来源于中国医科大学第一临床学院胸外科2 0 0 1 年1 2 月2 0 0 2 年 4 月手术的5 3 例患者，其中男3 3 例，女2 0 例，年龄1 5 7 6 岁，平均年龄 ( 5 5 5 1 2 7 ) 岁，肺癌患者4 3 例，肺良性瘤病变1 0 例( 4 例炎性假瘤、3 例 肺结核球、2 例肺错构瘤、1 例肺平滑肌瘤) ，配对的病灶旁正常肺组织4 3 例。对肺癌患者依据1 9 9 7 年新的
6、修订标准进行T N M 分期，其中I 期2 7例，期4 例，期9 例，期3 例。按病理形态学分为：鳞状细胞癌1 6 例，腺癌2 3 例，大细胞癌4 例。按分化程度分为：高、中分化癌1 2 例，低分化、未分化癌3 1 例。所有患者均为原发性肺癌，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。二、实验方法1 逆转录P C R 检测S u r v i v i n 基因表达取5 0 1 0 0 m g 组织，加入l m lT r i z o l 溶液彻底匀浆。按T r i z o l 试剂盒说 明书用一步法提取总R N A ，用D N A R N A 测定仪测定R N A 浓度和纯度。 反应体系中加入1 0 R
7、 N AP C RB u f f e r2 一、1 0 m Md N T Pm i x2 p l 、2 5 m MM g C l 2 4 斗l 、O l i g o ( d T ) ( 2 5 p m o l 山) 1 p I 、R n A ( 1 斗g 一) 2 一、R N a s ei n h i b i t o r( 4 0 u 山) 0 5 一、A M VR e v e r s eT r a n s c r i p t a s e ( 5 u 出) 1 一、d dH 2 07 5 一。反应条件：4 2 3 0 r a i n ，9 9 。C5 m i n ，5 0 C5 m i n 。
8、S u r v i v i n 基因引物序列为5 一G G A C C A C C G C A T C T C T A C A T ( 上游) 和5 一G C A C T I T C T I C G C A G T l l r C C ( 下游) 。在2 5 “反应体系中含有2 5 m m o l Ld N T P2 “l 、2 0 p m o l L 上下游引物各0 2 一、e D N A 3 一、T a qD N AP o l y m e r a s e( 5 U L ) 0 2 斗l 、1 0 B u f f e r2 5 止。反应条件：9 4 变性3 m i n ；9 4 0 Cl m
9、 i n ，2 5 5 I r a i n ，7 2 3 m i n ，3 5 个循环；7 2 延伸7 m i n 。用内参照B 一肌动蛋白 ( B a c t i n ) 检测逆转录效率。P C R 产物用2 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭 ( E B ) 显色。用G D S8 0 0 0 凝胶自动成像仪进行摄像分析。用币X 1 7 4 一H i n c( T a K a R a 公司) M a r k e r s 为分子大小对照确定阳性琼脂糖凝胶电泳条带。2 免疫组化法检测S u r v i v i n 、i ： 5 3 、b c l 一2 蛋白表达采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶连接( S P
10、 ) 免疫组织化学方法，一 抗S u r v i v i n 鼠抗人单克隆抗体( 工作浓度为1 ：3 0 ) 、P 5 3 鼠抗人单克隆即用型抗体、b c l 一2 鼠抗人单克隆即用型抗体，S P 试剂盒为福州迈新公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片作为阳性对照，用 P B S 代替一抗作为阴性对照。胞核或胞浆染为淡黄至棕黄色者为阳性细胞标志，将阳性细胞按其数量及显色强度分为3 级：表达弱阳性( + ) ，即阳性细胞数 6 0 ，多数细胞呈黄至棕黄色染色；表达中度阳性( + + ) ，即阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性之间。凡显色强度与背景无明显差别者为阴性。3 流式
11、细胞术检测肺癌细胞的增殖活性和凋亡水平切取深低温保存的组织块，网挫方法制备单细胞悬液，以P B S 调整细胞数为I 1 0 6 m l 。一份加P I 染色液( P I5 m g ，R N a s e2 m g ，T r i t o n X 一1 0 0l m l ，生理盐水6 5 m l ，枸椽酸钠1 0 0 r a g ，加蒸馏水至1 0 0 m 1 ) l r n l ，置4 冰箱中 避光染色3 0 r a i n 后上机分析。另一份中加入F I T C - - A n n e x i n V 及P I 各5 止，室温下避光静置1 5 r a i n 后上机分析。 所使用的流式细胞仪为F
12、 A C S C A N 型( B D 公司产品) 。光源为4 8 8 n m 氩离子激光器，F I T C 受激发后发绿色荧光，P I 发红色荧光，每份标本计数1 0 0 0 0 个细胞，然后在M a c i n t o s h6 5 0 计算机上用相关软件分析数据。 测量前，以人淋巴细胞作为标准品调校仪器的C V 值在3 0 以内。应用M o d i f a t 细胞周期分析软件，计算D N A 组方图各时相分布的百分比，以增殖指数( p r o l i f e r a t i o ni n d e x ，P I ) 表示增殖活性。二维点阵图上F I T C 高染而P I 低染( r T
13、T C + P I ) 者为早期凋亡细胞，计算其所占的百分比。4 统计学分析计数资料采用x 2 检验，计量资料采用t 检验，用S P S S l 0 0 软件完成。3 结果1 S u r v i v i nm R N A 表达在肺癌组织中为7 4 4 2 ( 3 2 4 3 ) ，良性瘤样病变和正常组织分别为3 0 ( 3 1 0 ) 和1 6 2 8 ( 7 4 3 ) ( X 2 = 3 0 9 ，P 6 0 ；m a n yc e l l sw e r ey e U o wo rb r o w ny e H o w ，m o d e r a t ep o s i t i v e( + +
14、 ) ，p o s i t i v ec e l ln u m b e ra n dc o l o ri n t e n s i t yw e r eb e t w e e nw e a kp o s i t i v ea n di n t e n s ep o s i t i v e I h es e c t i o nh a v i n gn oo b v i o u sp o s i t i v ee e l sW a sd e f i n e dn e g a -1 2 t i v e 3 F l o wc y t o m e t r yt od e t e c ta p o p t
15、o s i sa n dp r o l i f e r a t i o nT h et i s s u e sw e r er e s e c t e di nd e e p l o wt e m p e r a t u r e T h el i q u i dc o n t a i n i n gs i n g l ec e i lw a sr e g u l a t e db yP B Si n t o1 1 0 6 m 1 P Il i q u i d ( P I5 m g R n a s e2 m g T r t o n X 一1 0 0lm l ，n o r m a ls a l i
16、 n e6 5 m l ，s o d i u mc i t r a t e1 0 0 r a g ，a d dd i s -f i l l e dw a t e rt ol O O m l ) lm lW a sa d d e dt oo n e ，3 0 m i na t4 。Ci nd a r k ，a n dF I T CA n n e x i nVa n dP Ie a c h5 以w e r ea d d e dt ot h eo t h e r ，1 5 m i na tr o o mt e m p e r a -t u r ei nd a r k S t a i n e dc e i l sw e r ea n a l y z e db ym e a n so faF A C S c a r l ( B DC o r p ) a n dr e l a t i v em o d i f a ts o
