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1、荧光定量荧光定量PCRPCR技术讲座技术讲座-分子生物学实验技术系列讲座分子生物学实验技术系列讲座张志坤张志坤 20132013、0808、0808郑州瑞德生物技术有限公司 郑州瑞德基因技术研究中心郑州瑞德生物技术有限公司郑州瑞德生物技术有限公司 郑州瑞德基因技术研究中心郑州瑞德基因技术研究中心前言现代生物科学完全是建立在实验技术上的一门学科，每一次技术的进 步都极大地提高了生物科学的理论水平。从显微镜的发明到细胞学说的诞 生，从孟德尔的豌豆实验到遗传学第一、第二定律的提出，从X射线衍射 技术对核酸结构的分析到DNA双螺旋结构模型的建立，从测序技术的进步 到人类基因组计划的完成.还没有哪一门学
2、科的进步像生物学这样如 此依赖于实验技术的提升。生命科学的进步完全依靠对生物体内微观生命现象的研究，这就要求 研究者在实验时必须严谨、精细，必须一丝不苟地注意实验中的每一个环 节，精细地操作每一步实验，一丝不苟的分析每次的实验结果，步步为 营，细节决定成败。 简介简介大纲大纲一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论 二、引物及常见荧光探针的设计二、引物及常见荧光探针的设计 三、内参基因的选择三、内参基因的选择 四、反应体系的优化四、反应体系的优化 五、实验方案的选择五、实验方案的选择 六、误差分析及操作规范六、误差分析及操作规范 七、实验中污染的防控七、实验中污染的防控
3、 八、八、SNPSNP及稀有突变检测及稀有突变检测 九、实验结果的分析九、实验结果的分析一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论荧光定量荧光定量PCRPCR技术产生并成熟于上世纪技术产生并成熟于上世纪9090年代，由于该技年代，由于该技 术实现了术实现了PCRPCR从定性到定量的飞跃，能够对从定性到定量的飞跃，能够对PCRPCR反应的全过程进反应的全过程进 行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用短的十
4、几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为成为 分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论荧光定量荧光定量PCRPCR技术是在技术是在PCRPCR反应体系中加入荧光基团，利用反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号随着荧光信号随着PCRPCR反应的积累来实时监控反应的积累来实时监控PCRPCR反应的进程，并通反应的进程，并通 过分析软件对过分析软件对PCRPCR的反应进行检测分析的技术。的反应进行检测分析的技术。系统组成：定量系统组成：定量
5、PCRPCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念扩增曲线、阈值、扩增曲线、阈值、CTCT值值 （1 1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式左图反映的是随着左图反映的是随着PCRPCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指 数期很短；右图反映的是荧光信号数期很短；右图反映的是荧光信号的的变化量的对数与变化量的对数与PCRPCR反应循环数的关系，从右反应循环
6、数的关系，从右 图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都 采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 （2 2）、阈值线）、阈值线在荧光定量在荧光定量PCRPCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，扩增的指数期，画一条线，在此直线上， 所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的
7、差值全部相同。所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 （3 3）、）、CTCT值值PCRPCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。扩增循环数。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础荧光定量荧光定量PCRPCR是随着是随着PCRPCR循环的进行，以荧光信号强度的积循环的进行，以荧光信
8、号强度的积 累来实时反映累来实时反映PCRPCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特 点：点： （1 1）、本底低）、本底低 （2 2）、单位荧光强度高）、单位荧光强度高 （3 3）、每轮）、每轮PCRPCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧光强度的增高和每轮循环后光强度的增高和每轮循环后PCRPCR产物的量成线性关系产物的量成线性关系 （4 4）、没有）、没有PCRPCR产物时，没有荧光产物时，没有荧光 （5 5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，
9、各种荧光不会产生荧光的交叉干扰荧光不会产生荧光的交叉干扰一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 目前常用的几种荧光物质目前常用的几种荧光物质 （1 1）、）、TaqmanTaqman探针类探针类5 5 端标记荧光基团，端标记荧光基团，3 3 端标记淬灭基团，探针完整时，没有端标记淬灭基团，探针完整时，没有 荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光 ； 探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火
10、后探针 与目的基因互补序列结合，随着与目的基因互补序列结合，随着PCRPCR反应的进行，在反应的进行，在TaqTaq酶酶5 5 - - -3-3 外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 TaqmanTaqman常用的荧光基团和淬灭基团常用的荧光基团和淬灭基团 荧光基团：荧光基团：5 5 端常用荧光基团端常用荧光基团FAMFAM标记，最佳激发光波长：标记，最佳激发光波长：494-495nm494-495nm，最大，最大发射光波长：发射
11、光波长：518-520nm518-520nm。 淬灭基团：淬灭基团：TAMRATAMRA、BHQBHQ、ECLIPSEECLIPSE等。等。TAMRATAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500500560nm 560nm，最佳激发光波长在，最佳激发光波长在560nm560nm附近，对附近，对FAMFAM基团产生的发射光基团产生的发射光具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560560650nm650nm，当做，当做多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰
12、，并且本底较高，故现已不常用。不常用。BHQBHQ和和ECLIPSEECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较为常用，尤其在多重荧光定量为常用，尤其在多重荧光定量PCRPCR时常常被采用。时常常被采用。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 TaqmanTaqman探针的特点及应用探针的特点及应用 （1 1）、特异性强、准确性高）、特异性强、准确性高
13、本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCRPCR产物产物的量成正比关系，因此准确性极高。的量成正比关系，因此准确性极高。 （2 2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的用，普通的TaqTaq酶就能满足实验的要求。酶就能满足实验的要求。 （3 3）、常被用作基因含量的精确检测）、常被用作基因含量的精确检测( (精确度可达几十个拷贝精确度可达几十个拷贝) )及基因表达变化的精确分析（精确度可达及基
14、因表达变化的精确分析（精确度可达0.10.1倍的变倍的变 化）。化）。 （4 4）、水解类探针，需要）、水解类探针，需要TaqTaq酶酶5 5 -3-3 聚合酶及外切酶活性。聚合酶及外切酶活性。一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 （2 2）、荧光染料类）、荧光染料类目前常用的荧光染料为目前常用的荧光染料为SYBR GreenSYBR Green、SYBR GreenSYBR Green、SYTO9SYTO9等。其共同性质为：等。其共同性质为：（a a）、结合于双链核酸的小沟处）、结合于双链核酸的小沟处（b
15、b）、与双链）、与双链DNADNA结合后受激产生荧光结合后受激产生荧光（c c）、在变性条件下双链分开，荧光消失）、在变性条件下双链分开，荧光消失一、荧光定量一、荧光定量PCRPCR技术的基础理论技术的基础理论3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 荧光染料的特点及应用荧光染料的特点及应用 （1 1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高； （2 2）、可做双链核酸的熔解曲线分析；）、可做双链核酸的熔解曲线分析；
16、（3 3）、）、SYBR GreenSYBR Green染料本身价格便宜，但是做荧光定量染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCRPCR时对引物设时对引物设计的要求很高；对计的要求很高；对TaqTaq酶要求较高，最好是酶要求较高，最好是HotStar TaqHotStar Taq酶，或者操酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时； （4 4）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛； （5 5）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。 （6 6）、对）、对PCRPCR反应的毒性，能抑制
