《环氧化酶2及其选择性抑制剂尼美舒利对乳腺癌作用机制的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《环氧化酶2及其选择性抑制剂尼美舒利对乳腺癌作用机制的研究（133页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学博士学位论文环氧化酶-2及其选择性抑制剂尼美舒利对乳腺癌作用机制的研 究姓名：郭贵龙申请学位级别：博士专业：外科学（普通外科）指导教师：姚榛祥2003.5.1重庆医科大学博士研究生学位论文英文缩弓A OB pC O X 2C O X l B sD A BD E P CD M B AD M S Od N T PE BE D T AE G R lE RE R K l 2F C MG A P D HI t E P E SI 船I K KK DM D R 一1h 删T埘P2 ( 9 )符号说明英文全称中文名称a c rJd i n eo r a n g e吖啶橙b a s ep a i r
2、 s碱基对c y c l o o x y g e n a s e2环氧化酶一2c y c l o o x y g e n a s e 一2s e l e c t e di n h i b i t o t s选择性环氧化酶一2 抑制刺d i a m i n o b e z i d i n e二氨基联苯胺d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e焦炭酸二乙酯7 ，1 2 一di m e t h y l b e n z ( a ) a n t h r a c e n e二甲基苯并蒽d i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜d e o
3、x y r i b o n u c l e i ct r i p h o s p h a t e脱氧核苷三磷酸e t h i d i u mb r o m i d e澳乙锭e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸e a r l yg r o w t hr e s p o n s ef a c t o r早期生长反应冈子e s t r o g e nr e c e p t o r雌激素受体e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e g u I a t e dk i n a
4、 s e1 2胞外信号调肯激酶1 2F l o wc y t o m e t r y流式细胞术G l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t ed e h y d r oG e n a s e三磷酸甘油醛脱氢酶N - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e N2 一e t h a n e s u l fN - 2 一羟乙基呱一嗪N 、一2 乙磺o n ica c i d酸i n h i b i t o ro fk B船抑制因子I k Bk i n a s eI k B 激酶k i l o d
5、a l t o n干道尔顿m u l t i d r u g sr e s i s t a n c eg e n e 一1多药耐药基闪一l3 一( 4 ，5 - D i m e t h y l t h i a z o l 一2y 1 ) 一3 一( 4 ，5 - 二苯甲基噻唑一2 )2 ，5d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e一2 ，5 - 二苯基四氮唑嗅盐m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 一2 ( 9 j基质金属蛋自酶一2 ( 9 )重庆医科大学博士研究生学位论文m R N
6、 AM V DN A G 】N F 一七BN T MN P 一4 0N S A I D s0 1 3P C N AP G E 2P M S FP RR T P C RS D ST d TT E Mr E M E DT G F 一口1 r l s1 1 U N E Lm e s s e n g e rR N Am i c r o v a s c u l a rd e n s i t yN S A I D sa c t i v a t e dg e n e 一1a u c l e a rf a c t o tk a p p aBn i m e s u li d en o n s t e r o i
7、 d a la n t i i n f l a m m a t o r yd r u g so p t i c a ld e n s i t y信使R N A微血管密度计数N S A I D s 激活基阏核因子一柚尼美舒利乙基酚聚乙二醇醚非甾体类抗炎药光密度p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n细胞增殖核抗原p r o s t a g l a n d i nE 2前列腺素E ：p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e苯甲基磺酰氟p r o g e s
8、t e r o n er e c e p t o r孕激素受体R e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i n逆转录聚合酶链反应r e a c tl o ns n d i u md o d e c y l s u l f a t et e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e十二二烷基硫酸钠末端脱氧核苷酸转移酶t r a n s m is s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y
9、透射电镜术N ，N ，N ，N 。j t e t r a m e t h y le t h y l e n eD i a m i n eN ，N ，N 、，N 四甲基乙一胺t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r B转化生长因子一Bt r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e三羟基氨基甲烷T e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d yt r a n s f e r a s e d U T P 缺口末端标记法m e d i a
10、t e dd i g o x i g e n i nd U T Pn i c ke n d1 a b e l i n gv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o t血管内皮生艮闪子2重庆医科大学博士研究生学位论文环氧化酶一2 及其选择性抑制剂尼美舒利对乳腺癌作用机制的研究摘要第一部分环氧化酶一2 在人乳腺癌中的表达及其对肿瘤新生血管形成的影响j 第一节环氧化酶一2 在人乳腺癌中的表达和临床意义zl，、 r 目的：本研究旨在探讨C O X2 在乳腺癌组织中的表达和临床意义。访法：应：用逆转录聚合酶链反应( R T P C R
11、 ) 、免疫组化法及蛋白印迹法( W e s t e r nb l o t ) 分别检测人乳腺癌组织及配对的癌旁组织、远离肿瘤F 常乳腺组织的C O X 一2 m R N A 及其蛋白表达。结果：8 6 的癌组织C O X 2 m R N A 表达显著增高( 0 1 1 8 0 ) ；F 常乳腺组织几乎不表达；癌旁组织表达明显增高( O 0 6 5 2 ) 。癌与癌旁组织、正常乳腺组织C O X 一2 m R N A 的表达差异有显著性意义( P 0 0 5 ) ；5 0 “m 0 1 LN I M 明显下调M D A M B 一2 3 1 细胞的M D R l 、M M P 一2 、M M
12、P9 、E G R l m _ N A重庆医科大学博士研究生学位论文表达水平( P 1 6 进行下一步实验，同时依下列公式计算R N A 总量( ug ) 。将每一标本的总R N A 用D E P C 处理的去离子水调至l “g ul 。R N A 总量( ug ) = 4 0 O D 。稀释倍数( ug m 1 ) 总体积( m 1 )用0 2 D E P C 处理0 5 X T B E ，0 8 琼脂糖凝胶( 含0 5ug m l E B ) ，1 S D S 清洗电泳槽，凝胶电泳紫外灯下可见明确的2 8 S r R N A 、1 8S r R N A 、5 8S r R N A 三条带，
13、提示R N A 完整、未降解( 见图卜1 ) 。2 逆转录合成e D N A取lug 总R N A 、1 5u l0 1 i g d T ( 2 0 m m o l L ) 、d d H 。08u l 混匀、离心，7 0 。C 孵育5m i n ，迅速冰浴5 m i n i 依次加入d d H 2 03u 1 、5 缓冲液5u 1 、d N T P ( 2 5 r a m 。1 几)5H1 、R N A 抑制剂0 5ul 、M M L V 逆转录酶1pl ，反应总体积为2 5 ，混匀，3 7 。C 孵育l h 进行逆转录；9 0 。C 孵育5m i n ，迅速冰浴1 0m i n ，一2 0
14、。C 储存。3 P C R 反应用同一膜板e D N A 扩增C O X 一2 及内参对照B a e t i n 。C O X 一2 扩增产物为3 0 5 b p ”7 ，上游引物：5 “ - T T C A A A T G A G A TT G T G G G A A A A T - 3 、；下游引物：5 - A G AT C AT C TC T GC C TG A GT A TC T T - 3 、。通过软件设计B a e t i n 引物序列，2 l重庆医科大学博士研究生学位论文D a c t i n 扩增产物为8 3 7 b p ，E 游引物：5 “ - A T CT G G C A
15、CC A CA C CT T C T A CA A rG A GC T GC G 3 、；F 游引物：5 “ - C G TC A TA C TC C TG C TG A TC C AC A TC T GC 3 、。3 0ul 反应体系：d d H 2 01 6 9ul 、1 0 X 缓冲液3u1 、2 5 m MM g C I ：1 4ul 、d N T P ( 2 5 n _ l 【n 0 1 I 。) 1 2ul 、1 0uM 上游引物1 5ul 、下游引物1 5u1 、c D N A4ul 、T a g 酶0 5ul 。循环参数为：9 5 预变性5 m i n 、9 5 变性5 0 s
16、 、5 5 。| C 退火l m i n 、7 2 延伸l m i n ，循环3 5 次，后延伸7 2 7 m i n 。4 扩增产物的鉴定及分析取P C R 产物5ul 加6 上样缓冲液1ul ，1 8 琼脂糖凝胶，8 0 V 恒压电泳3 0m i n 。凝胶成像分析系统紫外光成像，分析各条带光密度值，用C O X 一2 光密度值同一泳道0 一a c t i n 光密度值的比值表示C O X 一2m R N A 的相对表达水平。( 二) W e s t e r nb l o t 检测C O X 一2 蛋白表达1 总蛋白的提取迅速称取1 0 0 m g 新鲜组织放入匀浆器，分次加入3 0 0pl 总蛋白裂解液，研磨至匀浆：移入新的E P 管；冰上裂解3 0m i n ，每1 0m i n 振荡一次，充分裂解：41 2 0 0 0 g 离心1 5m i r a 取上清，4 。C1 2 0 0 0 x g
