《双靶点干预对糖尿病大鼠视网膜VEGF和CTGF表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双靶点干预对糖尿病大鼠视网膜VEGF和CTGF表达的影响（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：蓬勤日期：w ，弓年j 月砷日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密U
2、，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密圈。( 请在相对应的方框内打“4 ”)学位论文作者签名：堑塑日期：w ，；年；月砷日导师签辞：日期：M 3 年J 月洱日( 气天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的1 在糖尿病大鼠视网膜中，研究结缔组织生长因子( c o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r , C T G F ) 和血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , V E G F )基因表达随时间变化，及透射电镜下观测大鼠视网膜微血管超
3、微结构的变化。2 探讨经玻璃体腔注射抗V E G F 新药l u c e n t i s 和C T G Fs t l I 矾A 后，C T G F 和V E G Fm R N A 表达水平及视网膜微血管超微结构的改变。方法1 将4 8 只大鼠随机分为糖尿病组( D M 组) 和正常对照组( C o N 组) ，在造模成功后8 、1 0 、1 2 周取大鼠视网膜标本行逆转录实时定量P C R 检测V E G F和C T G F 的基因表达变化。同时在各时点取各组大鼠眼杯，经戊二醛固定，透射电子显微镜观察。2 根据实验1 结果，在造模后1 0 周，将D M 大鼠随机分为l u c e n t i
4、s 单靶点干预组，C T G Fs h R N A 单靶点干预组，l u c e n t i s 和C T G Fs 1 1 I 矾A 双靶点干预组，未干预组，以及正常对照组。干预1 周后取各组大鼠的视网膜标本，行实时定量P C R 检测V E G F 和C T G F 的基因表达及透射电镜观察。结果1 实验1 ：在第8 周时D M 组大鼠视网膜C T G Fm R N A 水平较正常组显著增高( P = 0 0 3 7 ) 且一直持续到第1 2 周( 尸= 0 0 3 2 ，P = 0 0 3 9 ) ，而V E G F 的r n R N A水平在第1 0 周较正常对照组开始升高，持续到1
5、2 周，差异均有统计学意义( P = 0 0 4 3 ，P = 0 0 3 6 ) 。2 实验1 ：C O N 组未见异常，D M 组从第8 周开始出现异常改变，表现为视网膜血管内皮细胞肿胀，向管腔突出，细胞核内异染色质凝集居边，细胞质内线粒体明显肿胀，粗面内质网呈池样扩张，毛细血管基底膜增厚。且随着病程延长，改变更加明显，可见到闭锁的毛细血管，以D M l 2 组最为显著。3 实验2 ：L u c e n t i s 单靶点干预组，V E G F 基因表达较D M 未干预组显著降低( P = 0 0 1 4 ) ，而C T G F 表达较D M 未干预组则显著升高( P = 0 0 4 8
6、) ；C T G Fs h R N A 单靶点干预组，C T G Fm R N A 水平降至与正常对照组相似( P = 0 8 2 5 ) ，天津医科大学硕士学位论文而且V E G Fm R N A 表达也降低( P = 0 0 2 6 ) ；双靶点干预组，V E G F 和C T G Fm R N A 较未干预组均明显下调( P 1 6 7 m m o l L ，尿糖 卅视为建模成功，留做后续试验，剔除不符合此标准的大鼠3 只，最终D M 组为2 1 只大鼠造模成功后每周检测各组大鼠的血糖及体重情况。线路图见图1 1 1 2R T - P C R 检测大鼠视网膜C T G F 和V E G
7、F( 1 ) 主要试剂及器材 I A 提取试剂盒F e r m e n t a sG e n e J E T T MR N AP u r i f i c a t i o nK i t ，# K 0 7 31 逆转录试剂盒F e r m e n t a sR e v e r A i d T MF i r s tS t a n de D N AS y n t h e s i sK i t ，# K 16 2 2 荧光定量P C R 试剂盒R o c h eF a s t S t a r tS Y B RG r e e nM a s t e r ( R O X ) 匀浆器F l u k o 超细匀浆
8、器，德国，F 6 1 0 1 0 G 型 R e a lt i m eP C R 仪：A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司，美国7 9 0 0 H T 型 P C R 仪：E p p e n d o 吒德国电泳仪：美国B i o r a d 公司 低温离心机：B E C K M A NC O U L T E RA l l e g r a T MX 2 2 RC e n t r i f u g e( 2 ) 引物合成1 ) C T G F上游引物5 C C G C C A A C C G C A A G 筒叮3 下游引物5 C A C G G A C C C A
9、 C C G A A G A C 3 2 ) V E G F上游引物5 G G G C T C G C G G G A T T G 3 下游引物5 G C G C A G A C C A C G G C T A C T 32 ) G A P D H上游引物5 T G T G T C C G T C G T G G A T C T G A 3 下游引物5 C C T G C T T C A C C A C C T T C l v r G A 3以上引物均合成于北京六合华大基因科技股份有限公司，将引物用D E P C处理过的水溶解至l O O u M ，再稀释至l O u M ，2 0 保存( 3
10、 ) 实验方法各个时点将大鼠处死，迅速摘除眼球，去除眼前节，液氮收集大鼠视网膜7、天津医科大学硕士学位论文动态变化及视网膜微血管超微结构的改变 一、糖尿病大鼠视网膜中C T G F 与V E G F 表达的标本并在低温下充分匀浆，按照R N A 试剂盒说明，抽提总R N A ：按3 5 m il y s i sb u f f e r 加入7 0 9 l 配置裂解液，取标本5 0 - 1 0 0 m g ，加入裂解液l m l ，混匀，4 “ C 条件下1 2 ，0 0 0r p m 离心5 分钟，取上清液转入一个新的R N a s ef r e e 的离心管中，加入6 0 0 9 l 无水乙醇
11、，将溶液吹打成藕粉色，将溶液转移至粉色吸附柱中，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 分钟，将收集管中液体废弃；加入w a s hb u f f e r l7 0 0 9 l 至粉色吸附柱上，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 分钟，废弃滤过液；加入w a s hb u f f e r 26 0 0 9 l 至粉色吸附柱上，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 分钟，废弃滤过液；加入w a s hb u f f e r 22 5 0 9 l 至粉色吸附柱上，1 2 ，0 0 0r p m 离心2 分钟，废弃滤过液，继续离心1 2 ，0 0 0r p m 1 分钟；将吸附柱转移至新的R
12、N a s ef l e e 的离心管中，在吸附膜的中间部分加入5 0 9 l R N a s ef r e e 水，室温放置4 分钟，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟，将离心管中R N A 8 0 保存备用。A 浓度测定：取2 9 l R N A ，用R n a s ef r e e 的水配成1 0 0 p J 的样本液。以R n a s e f r e e 的水1 0 0 p 1作为空白对照，在紫外分光光度计分别读取2 6 0 n m ，2 8 0 n m 波长下的光密度值( o p t i c a ld e n s i t y ，O D ) O D 2 6 0 ，O D 2
13、 8 0 ，O D 2 6 0 n m O D 2 8 0 n m 的比值，计算R N A 的浓度。按如下公式计算总R N A 浓度，C R N “g g 9 1 ) = 4 0 9 9 m l x O D 2 6 0 x 稀释倍数1 0 0 0B 纯度测定：纯净R N A 样本O D2 6 0 n m O D2 8 0 n m 的比值均在1 8 2 0 之间，若比值较低( 1 6 ) 提示样本有蛋白的污染，比值高( 2 2 ) 提示样本有R N A 降解。每个标本取2 0 0n g 总R N A ，按逆转录试剂盒的说明，在2 0 t l 体系中合成c D N A 。将下列成分加入0 5 m
14、l 的R N a s e f r e e 离心管中混匀：总I 斟A2 0 0 n g10x R e a c t i o nB u f f e rw i t hM g C l 21 p lD N a s eI R N a s e f r e e1u lN u c l e a s e f l e e 水T o1 l g lP C R 仪内3 7 。C 孵育3 0 分钟，加入l g l5 0 m ME D T A 6 5 ，6 5 。C 孵育1 0 分钟。天津医科大学硕士学位论文动态变化及视网膜微血管超微结构的改变 一、糖尿病大鼠视网膜中C T G F 与V E G F 表达的将下列成分加入R N
15、a s e f r e e 离心管配置溶液成M ：O l i g o ( d T ) 18 ( 1 0 0 M m ，0 5 9 4 a )1 山5x R e a c t i o nB u f f e r4 U lR N a s eI n h i b i t o r ( 2 0 u I d )1 p l1 0 m Md N T PM i x2 1 a lR e v e r s eT r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0 u I _ d )1 p l将M 溶液加入第一个离心管中，P C R 仪内4 2 。C 孵育6 0 分钟，7 0 孵育5分钟，8 0 保存备用。然后，
16、以3 此c D N A 为模板加入靶基因上下游引物( 1 0 I t M ) 各0 6 I _ t L ，以及5 此2 X 通用性M a s t e rM i x ，再加入无核酸酶的H 2 0 补足1 0 此反应体系，在3 8 4 孔板中进行C y b e rG r e e n 实时P C R 扩增。实时P C R 扩增参数为：5 0 。C2 m i n孵育，9 5 1 0 r a i n 变性，然后4 0 次循环：9 5 1 5 s ，6 0 l m i n ，并加入解离阶段，9 5 1 5 s ，6 0 1 5 s ，9 5 1 5 s ，以判定扩增产物的特异性。扩增后，用2 - A A C t 法分析所得数据。( 4 ) 统计学处理获取的数据以均值标准差( X s ) 表示。采用S P S S l 8 0 统计学软件，用非配对t 检验对数
